金錢(qián)魚(yú)促性腺激素基因的克隆、原核表達(dá)及功能驗(yàn)證.pdf

1、在脊椎動(dòng)物中，性腺的發(fā)育和配子的形成及成熟主要受腦或下丘腦-垂體-性腺軸（BPG&HPG）的調(diào)節(jié)。脊椎動(dòng)物下丘腦分泌的促性腺激素釋放激素，使垂體分泌促性腺激素（gonadotropin hormones,GtH），即促卵泡激素（follicle-stimulating hormone,FSH）和促黃體生成素（luteinizing hormone,LH）作用于性腺，誘導(dǎo)并調(diào)控配子的形成。硬骨魚(yú)類(lèi)中，F(xiàn)SH和LH對(duì)生殖調(diào)控功能的實(shí)現(xiàn)依賴(lài)于

2、跟它們的受體相結(jié)合，啟動(dòng)下游信號(hào)傳導(dǎo)通路以及激活相關(guān)蛋白并誘導(dǎo)性激素的合成并且作用于配子的成熟及排放。
　　本文以實(shí)驗(yàn)室暫養(yǎng)的金錢(qián)魚(yú)（Scatophagus argus）為研究對(duì)象，運(yùn)用基因克隆技術(shù)、原核表達(dá)系統(tǒng)、組織學(xué)方法、實(shí)時(shí)定量熒光PCR、酶聯(lián)免疫測(cè)定（ELISA），對(duì)金錢(qián)魚(yú)的促性腺激素基因進(jìn)行克隆與序列分析、原核表達(dá)重組載體的構(gòu)建、重組蛋白的獲得及利用、注射和投喂處理后相關(guān)基因的表達(dá)、以及血清中性類(lèi)固醇類(lèi)激素含量的變化進(jìn)行

3、了研究及分析。
　　本研究相關(guān)結(jié)果如下：
　　（1）目的基因的克?。涸O(shè)計(jì)引物并利用基因克隆技術(shù)克隆金錢(qián)魚(yú)LH和FSH的cDNA全長(zhǎng)序列的克隆。金錢(qián)魚(yú)FSH基因全長(zhǎng)542bp，ORF為363bp，其編碼120個(gè)氨基酸。金錢(qián)魚(yú)LH的基因全長(zhǎng)608bp，ORF框?yàn)?38bp，其編碼145個(gè)氨基酸。將金錢(qián)魚(yú)FSH和LH氨基酸序列與其它魚(yú)類(lèi)進(jìn)行同源性比較，系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)結(jié)果表明，金錢(qián)魚(yú)FSH和LH的進(jìn)化地位與物種分類(lèi)的地位是一致的，在進(jìn)化

4、過(guò)程中比較保守。
　?。?）重組蛋白的構(gòu)建：構(gòu)建GtH與載體pET-28a的重組質(zhì)粒，在經(jīng)優(yōu)化后的原核表達(dá)條件下，誘導(dǎo)表達(dá)獲得可溶的重組FSH和LH融合蛋白。經(jīng)過(guò)Ni2+-NTA親和層析柱純化，Western Blot檢測(cè)得到純化的FSH和LH重組蛋白，隨后進(jìn)行金錢(qián)魚(yú)注射及青鱂（Oryzias latipe）投喂實(shí)驗(yàn)。
　?。?）性腺組織學(xué)的觀察：對(duì)實(shí)驗(yàn)對(duì)象金錢(qián)魚(yú)和青鱂分別進(jìn)行注射和投喂試實(shí)驗(yàn)，然后依照組織學(xué)觀察方法分別進(jìn)行

5、了掃描式電子顯微鏡（scanning Electron Microscope, SEM）和蘇木精-伊紅染色（hematoxylin-eosin staining, H&E）觀察。經(jīng)注射處理后，掃描隧道電鏡觀察發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)組金錢(qián)魚(yú)較對(duì)照組與空白組而言，卵巢中卵母細(xì)胞分化及成熟度較對(duì)照組更高。精巢中大部分精母細(xì)胞分化為支持細(xì)胞和精子，且精子成熟度較高。經(jīng)投喂處理后，組織學(xué)切片觀察發(fā)現(xiàn)，實(shí)驗(yàn)組青鱂較對(duì)照組與空白組而言，卵巢中卵子成熟度較高，卵黃顆

6、粒發(fā)育成熟。精巢中，精子細(xì)胞基本完全成熟，且部分已經(jīng)排出。
　　（4）相關(guān)基因的表達(dá)分析：利用相對(duì)實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對(duì)金錢(qián)魚(yú)生殖軸相關(guān)基因，促性腺激素受體（gonadotropin hormone receptor,GtHR），抗繆勒氏管激素（anti-Mullerian hormone,Amh），類(lèi)固醇激素合成急性調(diào)節(jié)蛋白（steroidogenic acute regulatory protein,Star），17β-羥基

7、類(lèi)固醇脫氫酶（17β-hydroxysteroid dehydrogenase,17β-hsd）等在金錢(qián)魚(yú)性腺組織中不同表達(dá)情況進(jìn)行研究。經(jīng)重組GtH注射后，SaFSHR和SaLHR表達(dá)量顯著升高（P＜0.05，P＜0.01），Amh表達(dá)水平顯著下降（P＜0.05），Star和17β-hsd表達(dá)升高（P＜0.05，P＜0.05）。
　?。?）類(lèi)固醇類(lèi)激素的測(cè)定：采用酶聯(lián)免疫測(cè)定法對(duì)金錢(qián)魚(yú)血清中性類(lèi)固醇類(lèi)激素，即雌二醇（Estrad

8、iol-17β,E2）和11-酮基睪酮（11-keto Testosterone,11-kT）分別進(jìn)行濃度測(cè)定，分別如下：雌性中，E2濃度分別約為312.77 pg/ml（0 dpt），337.90 pg/ml（7 dpt)）和474.57 pg/ml（14 dpt），呈現(xiàn)上升趨勢(shì)（P＜0.05）。雄性中，11-kT濃度分別約為70.88 pg/ml（0 dpt），65.67 pg/ml（7 dpt）和135.65 pg/ml（14 d

9、pt），濃度變化明顯升高（P＜0.01）。
　　本研究初步闡述了金錢(qián)魚(yú)GtH對(duì)其HPG生殖軸的調(diào)控機(jī)制，結(jié)果表明FSH和LH激活類(lèi)固醇合成過(guò)程，促進(jìn)的相關(guān)基因GtHR，Star，17β-hsd的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)控性類(lèi)固醇激素E2和11-kT的生物合成，并作用于性腺發(fā)育和配子發(fā)生。另外，抑制Amh的表達(dá)以促進(jìn)雌二醇（estradiol,E2）和11-酮基睪酮（11-keto Testerone,11-kT）的生物合成使得卵黃發(fā)生和配子形