許氏平鲉和半滑舌鰨促性腺激素釋放激素(GnRH)基因的克隆和表達分析.pdf

1、促性腺激素釋放激素(Gonadotropin-releasing hormone,CnRH),是一種十肽神經(jīng)激素,是作用于下丘腦-垂體-性腺軸的(HPG)關(guān)鍵分子。許氏平鮋(Sebastes schlegelii)有抗病力強、個體大、生長速度快、卵胎生等優(yōu)勢,已成為我國北方重要的養(yǎng)殖魚類。半滑舌鰨(Cynoglossus semilaevis)是我國近海的一種大型名貴的海水經(jīng)濟魚種,具有生長快等優(yōu)點。對這兩種魚類的GnRH及其受體的類型

2、、分布和作用的研究可以為闡明CnRH對HPG軸的調(diào)控機制提供一定的理論依據(jù)。
　　(1)本研究通過同源克隆和RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技術(shù)獲得了許氏平鼬的3種以及半滑舌鰨的1種GnRH全長cDNA,通過生物軟件分別對其進行預(yù)測分析,并利用實時熒光定量技術(shù)對這些基因在不同組織及發(fā)育時期的時空表達進行了研究;A.許氏平鮋GnRH-Ⅰ cDNA序列全長424 bp,ORF為288 bp,

3、包括61 bp的5'UTR,36 bp和3'UTR。通過軟件預(yù)測,該基因編碼了一個含有96個氨基酸的蛋白質(zhì)前體,分子量為10.4 kDa,在該蛋白的N末端包含一個由22個氨基酸殘基組成的信號肽。qPCR結(jié)果顯示,GnRH-I在許氏平觸雌雄成體的各9種組織中均有表達,其中在全腦組織和卵巢組織中表達量最高;B.許氏平鮋GnRH-Ⅱ cDNA全長615 bp,ORF為258 bp,包括146 bp的5'UJTR和184 bp的3'UTR。預(yù)測

4、其編碼86個氨基酸,分子量9.6kDa,在該蛋白的N末端包含一個由23個氨基酸殘基組成的信號肽。qPCR結(jié)果顯示,除了在性腺與全腦組織外,GnRH-Ⅱ只在許氏平鮋雌雄成體的心臟、脾、肌肉和腸中表達,仍以全腦組織和卵巢組織中表達量為最高;
　　C.許氏平鮋GnRH-Ⅲ cDNA全長506 bp,ORF為273 bp,包括45 bp的5'uTR和156 bp的3'uTR。預(yù)測其編碼91個氨基酸,分子量10.1 kDa,在該蛋白的N末端

5、包含一個由23個氨基酸殘基組成的信號肽。qPCR結(jié)果顯示,GnRH-Ⅲ只在許氏平鮋雌雄成體的性腺與全腦組織中表達;
　　另外,利用qPCR分析發(fā)現(xiàn)許氏平觸的CnRH-Ⅰ、GnRH-Ⅱ和GnRH-Ⅲ基因在發(fā)育時期的表達均出現(xiàn)較大的波動性。
　　D.半滑舌鰨GnRHⅢ cDNA全長344 bp,ORF為276 bp,包括36 bp的5'UTR和32 bp的3'UTR。預(yù)測其編碼92個氨基酸,分子量10.3 kDa,在該蛋白的N末

6、端包含一個由23個氨基酸殘基組成的信號肽。qPCR結(jié)果顯示,CmRH-Ⅲ只在半滑舌鰨雌雄成體的性腺與全腦組織中表達;發(fā)育時期半滑舌鰨GnRH-Ⅲ為母源性表述,且其胚胎孵化前后波動較大。
　　通過軟件預(yù)測發(fā)現(xiàn)許氏平鮋3種GnRH以及半滑舌鰨CmRH-Ⅲ都屬于分泌型的蛋白,氨基酸序列比對分析表明以上預(yù)測出的GnRH前體氨基酸序列與其他硬骨魚類的相似性均較高,顯示出硬骨魚類的CnRH基因在進化中的高度保守性。各組織qPCR表達分析顯示以

7、上GnRH均在與繁殖軸相關(guān)組織中的表達量較高,推測其在該物種的繁殖中有重要作用,可能參與整個繁殖過程。
　　(2)通過同源克隆和RACE技術(shù)獲得長度為2359 bp的許氏平觸GnRHR-1全長cDNA,包含304 bp的5'UTR、1281 bp ORF和774 bp的3'UTR,編碼426個氨基酸。結(jié)構(gòu)域預(yù)測表明許氏平鮋GnRHR-Ⅰ含有7個跨膜結(jié)構(gòu)域,屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族,具有典型的G蛋白偶聯(lián)受體特征:包含1個胞外N=末端尾

8、巴、3個胞外loop、3個胞內(nèi)loop、7個跨膜α螺旋以及1個胞內(nèi)C.末端尾巴。qPCR分析顯示,GnRHR-ⅠmRNA在許氏平鮋雌雄成體的全腦組織和性腺組織中均有較強的表達,脾臟和腎臟中沒有檢測出信號,在其余6個組織中表達量均較低。
　　(3)通過染色體步移法對許氏平鮋3種類型的GnRH的啟動子區(qū)克隆并分別對其進行生物信息學(xué)的預(yù)測分析:GnRH1、GnRH2和GnRH3基因啟動子區(qū)域的序列長度依次約為4k bp,3.5k bp以

9、及2.5k bp。在GnRH1和GnRH3的轉(zhuǎn)錄起始點TSS上游31 bp處均有1個典型的TATA box,GnRH2的。TSS上游80 bp左右有1個典型的GC box。在3個GnRH基因的啟動子序列中,均存在Sp1、NF-1、Pit-1、C/EBP、CREB、Oct-1、GATA-1、Brn、USF和MyoD等轉(zhuǎn)錄因子,以及AR、ER、PR、GR、RAR和RXR等類固醇類核受體的結(jié)合位點,推測其對GnRH的調(diào)控起到關(guān)鍵作用。在GnR

10、H1和GnRH2的啟動子中還預(yù)測出TR和OIf-1結(jié)合位點,而在GnRH3不存在,推測這些轉(zhuǎn)錄因子對這3種不同類型的GnRH基因的調(diào)控存在特異性。此結(jié)果表明不同類型的黑鮶GnRH是受不同的機制調(diào)控的,從而在生理過程中發(fā)揮著不同的作用。(4)構(gòu)建了許氏平觸GnRH-Ⅲ的大腸桿菌表達系統(tǒng):以pET32a為表達質(zhì)粒,將GnRH-Ⅲ cDNA序列(去掉編碼信號肽部分的序列)插入其中構(gòu)建了pET-32a/GnRH-Ⅲ重組質(zhì)粒,并在BL21(DE3