促性腺激素在雌性半滑舌鰨繁殖周期的生理功能研究.pdf

1、本文以人工養(yǎng)殖半滑舌鰨（Cynoglossus semilaevis Günther）為研究對象，運用組織學、內(nèi)分泌學方法、激素放射免疫測定方法以及分子生物學方法，對半滑舌鰨卵巢發(fā)育、促性腺激素（Gonadotropin Hormone, GtH）水平周期變化及其基因的克隆、表達水平等進行了系統(tǒng)的分析與研究，以期進一步闡明GtH的生理功能，為改善工廠化養(yǎng)殖魚類的生殖調(diào)控提供有價值的參考信息。主要研究內(nèi)容與結(jié)果如下：
　　1.半滑舌

2、鰨促性腺激素α亞基（CGα）基因的克隆及其時空表達分析
　　采用RACE方法，從半滑舌鰨腦垂體中克隆了CGα全長cDNA。半滑舌鰨CGα基因全長為685bp，其開放閱讀框為384bp，編碼了含127個氨基酸的蛋白，N端33個氨基酸為信號肽。半滑舌鰨CGα成熟肽與其它脊椎動物CGα成熟肽結(jié)構特征相似，具有10個半胱氨酸殘基和2個N-糖基化位點。CGα成熟肽序列分析表明，半滑舌鰨CGα與鰈形目和鱸形目魚類CGα同源性最高為60-70％

3、。
　　實時熒光定量PCR結(jié)果表明，半滑舌鰨CGαmRNA在被檢測的12個組織中均有表達，在垂體組織中大量表達，其次是鰓、腎臟、肌肉、卵巢和腦組織，在心臟、頭腎、肝和脾等組織中只微量表達；對繁殖周期CGα表達水平進行測定有助于理解魚類的分子調(diào)控機理。RT-PCR結(jié)果表明，繁殖周期雌性半滑舌鰨CGαmRNA在Ⅳ、Ⅴ期表達量最豐富。
　　2.半滑舌鰨促濾泡激素（FSH）基因全長cDNA克隆、時空表達
　　利用RT-PCR和

4、RACE技術首次克隆得到半滑舌鰨FSH基因全長cDNA序列。全長為541bp，開放閱讀框為393bp，編碼130個氨基酸。發(fā)現(xiàn)一個N-糖基化位點：24-27 NTT。與其它脊椎動物的FSH成熟肽氨基酸序列同源性比較表明：半滑舌鰨FSH與鰈形目和鱸形目魚類FSH同源性最高為42-49%。
　　實時熒光定量PCR組織表達分析表明，F(xiàn)SH mRNA除在垂體中大量表達外，其他組織也有表達，尤以腦、性腺表達量較高。半滑舌鰨 FSH mRNA

5、在垂體以外組織中的廣泛表達，暗示FSH可能具有廣泛的生理功能。RT-PCR方法對繁殖周期雌性半滑舌鰨FSH基因表達水平進行測定，結(jié)果表明，F(xiàn)SH mRNA在Ⅳ期表達促性腺激素在雌性半滑舌鰨繁殖周期的生理功能研究量最豐富。
　　3.半滑舌鰨促黃體激素（LH）基因全長cDNA克隆、時空表達
　　利用RACE技術首次克隆了半滑舌鰨腦垂體中LH基因cDNA全長序列。該基因全長670bp，開放閱讀框為477bp，編碼158個氨基酸。與

6、其它脊椎動物的LH成熟肽氨基酸序列同源性比較表明：半滑舌鰨 LH與鰈形目和鱸形目同源性高58-68%。另外，半滑舌鰨LH含有12個保守的半胱氨酸殘基和1個N-糖基化位點（19-21NQT）。
　　實時熒光定量組織表達分析表明，LH mRNA在腦、垂體、鰓、心、頭腎、腎、肝臟、脾臟、胃、腸、卵巢、肌肉這12組織中均有表達，垂體中表達量最豐富，其他組織尤以腦、性腺表達量較高。推測半滑舌鰨LH可能具有廣泛的垂體外生理功能；RT-PCR方

7、法對繁殖周期雌性半滑舌鰨LH表達水平進行測定，結(jié)果表明，LH mRNA在Ⅳ、Ⅴ期表達量最豐富。
　　4.促性腺激素（GtH）含量測定及周年變化規(guī)律
　　利用125I標記的放射免疫測定（RIA）技術檢測繁殖周期半滑舌鰨血漿GtH濃度及周年變化規(guī)律。結(jié)果表明：FSH在繁殖周期的Ⅳ期表達量最豐富；而LH在Ⅴ期表達量最大。雌性半滑舌鰨血漿FSH和LH濃度的周年變化相似，呈現(xiàn)明顯的周期性規(guī)律，都在9月時出現(xiàn)全年周期中的波峰。統(tǒng)計分析表