斜帶石斑魚白細胞介素-1β基因的克隆鑒定和功能研究.pdf

1、本研究結(jié)果如下： 1.本研究克隆的斜帶石斑魚IL-1β基因由5個外顯子和4個內(nèi)含子組成，其cDNA序列由1，364個堿基組成，含有一個長765 bp的開放讀碼框，編碼一段含254個氨基酸的前體蛋白。與其他魚類IL-1β相似，斜帶石斑魚IL-1β基因所編碼的蛋白擁有12個β-折疊鏈，IL-1家族標識序列和3’非編碼區(qū)的mRNA不穩(wěn)定基序，但缺少了分泌蛋白的信號肽序列以及哺乳動物中保守的IL-1β轉(zhuǎn)換酶切割位點。與其他脊椎動物IL-

2、1β核苷酸序列和氨基酸序列同源性分析和進化樹分析發(fā)現(xiàn)，斜帶石斑魚IL-1β與鱸形目和鰈形目IL-1β親緣關(guān)系最近，與哺乳動物進化關(guān)系最遠。 2.斜帶石斑魚IL-1β基因在所檢測的神經(jīng)組織和外周組織中廣泛表達。除前腸、脂肪和卵巢外的外周組織都能表達IL-1β mRNA，其中以脾臟、頭腎、腎臟、肝臟、心臟和鰓的IL-1β基因表達量較高，其次是紅肌、后腸、胸腺和胃。在端腦、下丘腦、中腦．丘腦、小腦和垂體等神經(jīng)組織中均能檢測到IL-1β

3、mRNA的表達。這些證據(jù)顯示，斜帶石斑魚IL-1β可能參與體內(nèi)局部和全身的信號傳遞。 使用不同的分裂素(雙鏈RNA類似物，Poly I：C；植物凝集素，PHA；伴刀豆球蛋白，ConA；脂多糖，LPS)刺激斜帶石斑魚外周血白細胞，都能誘導(dǎo)IL-1β基因的表達，并以Poly I：C和LPS效果最為顯著，但Poly I：C和LPS的作用效果并不相同。上述研究結(jié)果說明IL1β基因可能通過與哺乳動物類似的途徑參與抵御感染的免疫應(yīng)答。

4、 本研究首次報道魚類腦部不同分區(qū)組織的IL-1 β分布情況，及分裂素PHA，ConA和Poly I：C對魚類IL-1β基因表達的影響。 3.利用大腸桿菌系統(tǒng)重組表達斜帶石斑魚IL-1β成熟肽。通過對誘導(dǎo)的時間、溫度和IPTG濃度的優(yōu)化，在30℃，0.5 mM IPTG誘導(dǎo)4小時后獲得高產(chǎn)量，可溶性的斜帶石斑魚重組IL-1β蛋白。以抗組氨酸標簽的單抗為一抗的Western雜交鑒定純化和脫鹽后的重組蛋白確為斜帶石斑魚IL-1β蛋白

5、。 利用該重組蛋白對新西蘭雄兔進行免疫，經(jīng)ELIJSA和Westem雜交鑒定，所制備的斜帶石斑魚IL-1β多克隆抗血清效價較高，并具有一定的特異性。 4.通過細胞增殖實驗檢測斜帶石斑魚重組IL-1β蛋白的生物活性，發(fā)現(xiàn)10ng／ml以上濃度的重組蛋白已經(jīng)能夠有效刺激斜帶石斑魚頭腎細胞的增殖，并存在劑量依存效應(yīng)。通過離體孵育和RT-PCR技術(shù)檢測，發(fā)現(xiàn)無論在斜帶石斑魚外周血白細胞還是頭腎細胞中，10 ng／ml重組蛋白都能

6、比lO gg／ml LPS更強力的誘導(dǎo)下游炎癥因子COX-2和IL-1β本身mRNA的表達。 結(jié)果說明，原核系統(tǒng)表達的斜帶石斑魚IL-1β重組蛋白能夠促進免疫細胞活化增殖，以及啟動和調(diào)節(jié)下游基因COX-2和IL-1β基因表達的生物學活性，有望作為免疫調(diào)節(jié)劑應(yīng)用于實際生產(chǎn)，提高魚類抗病能力。 5.采用RT-PCR．技術(shù)，檢測斜帶石斑魚IL-1β重組蛋白和MAPK信號通路抑制劑共刺激孵育對斜帶石斑魚頭。腎細胞COX-2和IL