斜帶石斑魚干擾素調(diào)節(jié)因子1(IRF-1)的克隆鑒定及特征分析.pdf

1、IRF家族在魚類非特異性免疫中發(fā)揮重要作用，一直受到人們廣泛關(guān)注。本研究首次分別對斜帶石斑魚IRF家族的一個基因(IRF-1)進行克隆，并選擇其中的一個重要基因：干擾素影響因子1——Interferon regulator factor1(IRF-1)進行了克隆鑒定、誘導表達和初步功能分析，以從分子機制上對斜帶石斑魚的防病和分子疫苗的研制打下基礎(chǔ)。 干擾素影響因子1是干擾素家族的第一個成員，在免疫應(yīng)答、抗病毒、細胞生長調(diào)節(jié)以及細

2、胞凋亡等生物過程中發(fā)揮著重要的作用。 本文對斜帶石斑魚的IRF-1基因進行了克隆，測序及各種特征化研究的研究。以PBS做對照利用polyI:C刺激斜帶石斑魚(Epnephelus coioides)，然后采肝臟、頭腎、脾臟、肌肉、腦、心臟提取總RNA。根據(jù)相近物種IRF-1的保守序列設(shè)計引物，PCR得到了保守片段，通過RT-PCR和RACE-PCR，獲得了斜帶石斑魚JRF-1基因的cDNA全長，同樣的方法獲得了IRF-1基因DN

3、A全長。 EcIRF-1基因cDNA全長為1759bp，完整ORF框906bp，編碼302個氨基酸，5’非編碼區(qū)182bp，3’非編碼區(qū)671bp。EclRF-1基因組由十個外顯子和九個內(nèi)含子組成，約4.3kb。基因5’非翻譯區(qū)包含一個外顯子和一個內(nèi)含子，3’非翻譯區(qū)包含一個外顯子。EcIRF-1基因cDNA與海鱖(Siniperca chuatsi)同源性最高，為85％。將IRF-1 ORF推測的氨基酸序列與其他物種進行比對

4、，斜帶石斑魚與海鱖同源性為90％，金頭鯛(sparusaurat)88％，烏鱧(Channa argus)86％，大菱鲆(Scophthalmus maximus)82％。利用ORF)芋列，構(gòu)建原核重組表達質(zhì)粒。重組質(zhì)粒經(jīng)PCR、酶切鑒定及測序驗證后轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)，經(jīng)IPTG誘導，重組蛋白成功表達，表達的蛋白約55 KDa。誘導溫度在37℃時，重組蛋白主要以包涵體形式存在，但當誘導溫度降到30℃的時，重組蛋白中可溶性蛋白