草魚IRF-2、IRF-3基因的克隆、鑒定及IRF-1的功能分析.pdf

1、干擾素調(diào)節(jié)因子(IRF)在細(xì)胞抗病毒先天免疫反應(yīng)過(guò)程中有著重要的調(diào)節(jié)作用。近年來(lái)，雖然對(duì)魚類干擾素系統(tǒng)研究取得重大進(jìn)展，但對(duì)其具體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)路徑和分子機(jī)理仍不甚清楚。本研究成功克隆與鑒定了草魚干擾素調(diào)節(jié)因子2(CiIRF-2)和調(diào)節(jié)因子3(CiIRF-3)，并著重對(duì)實(shí)驗(yàn)室前期克隆的IRF-1的功能進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示:CiIRF-2全長(zhǎng)cDNA為1809 bp，其中包括35bp的5'非翻譯區(qū)(5'-UTR)、793bp的3'非翻譯區(qū)(3'

2、-UTR)和1個(gè)編碼326個(gè)氨基酸的981bp的最大開放閱讀框（ORF）。這個(gè)推測(cè)的CiIRF-2多肽序列中存在1個(gè)含有6個(gè)保守色氨酸(W)殘基的保守DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域(DBD)。多重比對(duì)分析表明，CiIRF-2與多種硬骨魚類及其他高等哺乳動(dòng)物的IRF-2具有較高的同源性，且與斑馬魚的關(guān)系最為密切。CiIRF-3的全長(zhǎng)cDNA包含1831 bp，其中含1個(gè)262 bp的3'-UTR、1個(gè)192bp的5'-UTR及1個(gè)1377bp的最大OR

3、F。這個(gè)ORF編碼458的氨基酸的蛋白質(zhì)，其N-端包含一個(gè)含有5個(gè)保守色氨酸的DBD結(jié)構(gòu)域，而其C-端則包含1個(gè)較保守的IRF協(xié)助結(jié)構(gòu)域（IAD）。多重比對(duì)分析表明，CiIRF-3與其他比對(duì)的其他高等脊椎動(dòng)物的IRF-3具有較高的同源性。除腦組織外，CiIRF-3在各檢測(cè)組織中的本底表達(dá)水平均較低，經(jīng)Poly I:C刺激后，各檢測(cè)組織中CiIRF-3的轉(zhuǎn)錄表達(dá)水平迅速上升，在肝臟組織和脾臟組織中變化量最為明顯。凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)表明原核表達(dá)純

4、化的CiIRF-3與草魚IFN啟動(dòng)子片段有較強(qiáng)的親和性。該結(jié)果表明CiIRF-3可能與草魚IFN的轉(zhuǎn)錄有著潛在的密切關(guān)系。
　　 RT-PCR表明在所檢測(cè)的組織中CiIRF-1均有較低的本底表達(dá)，如果受到PolyI:C或重組草魚干擾素(rCiIFN)刺激后，CiIRF-1的表達(dá)量將迅速上調(diào)。體外凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)表明，重組CiIRF1與草魚IFN及IRF1的啟動(dòng)子片段均有不同程度的結(jié)合。重組質(zhì)粒pcDNA3.1-CiIRF-1與pGL