大菱鲆信號轉導及轉錄激活因子1(STAT1)和牙鲆干擾素調節(jié)因子9(IRF9)全長cDNA克隆與表達分析.pdf

1、大菱鲆(Scophthalmus maximus)和牙鲆(Paralichthys olivaceus)是我國沿海和北方地區(qū)重要的海水養(yǎng)殖魚類品種。近年來,隨著海水養(yǎng)殖不斷迅速發(fā)展,不僅帶動了我國經濟的發(fā)展,也增加了勞動就業(yè)機會,緩解了人口食物需求對陸地農業(yè)的壓力,但隨之更深層次問題陸續(xù)出現(xiàn),發(fā)展的越來越嚴重,尤其病毒性疾病,給海水養(yǎng)殖的經濟利益帶來了嚴重的不利影響。干擾素(interferons,IFN)在抗病毒免疫過程中具有重要的作

2、用,因此,對大菱鲆和牙鲆干擾素系統(tǒng)中的有關的基因的深入研究具有不可估量的重大意義。
　　該研究分別采用逆轉錄-聚合酶鏈式反應(RT-PCR)、同源PCR克隆(Homology PCR Cloning)和cDNA末端快速擴增(Rapid Amplification of cDNA ends,RACE)技術,從大菱鲆和牙鲆脾臟組織中分別獲得STAT1(transcription factors signal transducers a

3、nd activators of transcription1)和IRF9(Interferon regulatory factors9)基因的全長cDNA序列。STAT1涉及Ⅰ和Ⅱ IFN信號通路,在實驗研究中成功克隆的大菱鲆 STAT1有3種不同的cDNA變異體(全長分別為3072 bp,2970 bp和2960 bp),它們僅僅在3’非翻譯區(qū)( untranslated region,UTR)不同。序列分析表明,cDNAs是由不同

4、的加尾位點形成。STAT1 cDNA所編碼的750個氨基酸,與其他魚類的STAT1s具有58.8-92.7％的一致性,并且擁有DBD(DNA binding domain), SH2(SH2 domain), TAD(transcriptional activation domain)區(qū)域。本文克隆的另一基因牙鲆IRF9,cDNA長3305 bp,包括272 bp5’-UTR,1725 bp3’-UTR,編碼435個氨基酸殘基包含有 D

5、BD,IAD(IRF association domain),NLS(nuclear localization signal),PRD(proline-rich domain)等區(qū)域。牙鲆IRF9的序列同其他魚類具有33.7-72.0%的一致性和61.9-80.5%的相似性。
　　定量PCR分析大菱鲆STAT1和牙鲆 IRF9在12種組織中即腦、鰓、胃、腸、心、頭腎、體腎、肝、脾、性腺、肌肉和皮膚組織的表達。實驗結果表明都呈組成型

6、表達,大菱鲆STAT1在腸,頭腎,肝臟,脾臟組織中表達量較高;牙鲆 IRF9在頭腎,腎,肝臟,脾臟組織中的表達量較高。
　　此外,我們還利用定量PCR研究了大菱鲆STAT1受到poly I:C和TRBIV誘導后在0h,3h,6h,12h,1d,2d,3d,4d,5d,7d時間點,牙鲆IRF9分別在0h,3h,6h,12h,1d,2d,3d,4d,5d,7d時間點受到polyI:C和在0h,6h,12h,18h,1d,2d,3d,4

7、d,5d,7d時間點受到LCDV誘導后的動力學表達模式。實驗表明大菱鲆STAT1和牙鲆IRF9在受到外源刺激的7d早期階段,poly I:C均是快速的誘導者。在分別受到2種外源刺激后,大菱鲆 STAT1和牙鲆IRF9表達最強烈,最快的均是脾臟組織。就poly I:C誘導而言,大菱鲆STAT1在脾,腎臟,鰓,肌肉的最高表達量為2.7-,3.9-,4.2-和4.4倍。此外,鰓和脾臟組織分別在5 d,3 d時間點出現(xiàn)弱峰,表達量分別是2.8和

8、3.5倍。而牙鲆IRF9除了在脾臟中有所表達,在其他組織中的表達微弱,脾,鰓,頭腎,肌肉中的表達量分別是8.6-,1.4-,1.3-和2倍;這些結果表明 STAT1和 IRF9均參與到了宿主的抗病毒免疫反應中。就大菱鲆受 TRBIV誘導而言, STAT1基因表達最高量在鰓,頭腎,脾和肌肉中分別在2 d,1 d,3 d,5 d以表達量3.4倍,3.5倍,4.5倍和2倍出現(xiàn);而頭腎和脾臟中5 d,3 d出現(xiàn)第2波峰,表達量分別為2.9倍和4