番茄MBF1轉(zhuǎn)錄輔激活因子基因的克隆、表達(dá)分析及遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、逆境脅迫因子主要有干旱、鹽漬、低溫、水澇等，是限制植物生長(zhǎng)和區(qū)域分布以及影響農(nóng)作物產(chǎn)量和質(zhì)量的重要因素。植物對(duì)這些逆境脅迫的適應(yīng)主要被轉(zhuǎn)錄因子和調(diào)節(jié)基因(諸如控制多重抵御的酶、蛋白等)所介導(dǎo)?，F(xiàn)有研究證明，與轉(zhuǎn)錄因子活力有關(guān)聯(lián)的是轉(zhuǎn)錄輔激活子，它能增強(qiáng)轉(zhuǎn)錄因子和順式作用元件的結(jié)合。MBFl是一個(gè)轉(zhuǎn)錄輔激活子，通過(guò)一個(gè)激活物和一個(gè)TATA盒結(jié)合蛋白的橋連作用來(lái)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄激活。MBFl基因最早是在蠶、果蠅等動(dòng)物體中被發(fā)現(xiàn)，后來(lái)在植物中也發(fā)現(xiàn)了

2、MBFl基因。據(jù)報(bào)道，在擬南芥中的MBFl基因的超表達(dá)能增強(qiáng)其抵抗逆境脅迫的能力，而在番茄中關(guān)于此基因還沒(méi)有相關(guān)的報(bào)道，本論文擬通過(guò)在番茄中超表達(dá)MBFl基因研究其對(duì)逆境脅迫的抗性能力，從而明確MBFl基因的分子作用機(jī)制，主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下： 1．番茄MBFl基因的克隆以AC<'++>番茄果實(shí)的總RNA為模板，體外反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以cDNA為模板，通過(guò)PCR擴(kuò)增得到得632 bp大小的片段，將其命名為L(zhǎng)eMBFl，并登錄

3、NCBIGenBank，登錄號(hào)為EF051474。將其與擬南芥中的MBFl基因進(jìn)行同源性比較，在氨基酸水平上的序列相似性為82％，是一個(gè)新基因。 2．Northern雜交技術(shù)分析番茄LeMBFl基因的表達(dá)特性克隆番茄MBFl(LeMBFl)基因特異片段，以此作為探針，通過(guò)Northem雜交技術(shù)分析LeMBFl基因的表達(dá)特性，結(jié)果顯示LeMBFl基因的表達(dá)能被高溫、干旱誘導(dǎo)，被復(fù)水所影響，同時(shí)LeMBFl基因的表達(dá)水平也在Nr(N

4、ever-ripening，Nr)番茄 and rin(ripening inhibitor,rin)番茄中被檢測(cè)。外源乙烯處理綠熟期果實(shí)，LeMBFl基因的表達(dá)變化不明顯，說(shuō)明在這一時(shí)期外源乙烯并不誘導(dǎo)LeMBFl基因的表達(dá)。 3．雙元超表達(dá)載體pBINl9-MBFl的構(gòu)建驗(yàn)證的LeMBFl基因與經(jīng)Pst Ⅰ酶切的pDH51載體通過(guò)T4 DNA連接酶連接，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)經(jīng)PCR以及酶切鑒定確為重組中間載體質(zhì)粒，且外源片段方向正確，

5、命名為pDH51-MBFl。中間載體pDH51-MBFl經(jīng)EcoR Ⅰ酶切獲得了包含35s啟動(dòng)子、MBFl基因、35S終止子的片段，此片段與經(jīng)EcoR Ⅰ酶切的pBIN19載體連接，連接產(chǎn)物經(jīng)PCR及酶切鑒定確為重組植物雙元表達(dá)載體質(zhì)粒，命名為pBIN19-MBFl。 4．再生番茄植株的獲得以AC<'++>番茄子葉為外植體，通過(guò)農(nóng)桿菌LBA4404介導(dǎo)，將CaMV 35S啟動(dòng)子調(diào)控下的LeMBFl轉(zhuǎn)入番茄，經(jīng)過(guò)50 mg/L K