楊樹PtWRKY36-1轉(zhuǎn)錄因子編碼基因的克隆及轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、摘要楊樹是我國重要的造紙資源樹種，降低其木質(zhì)素含量或改變其組分是提高其紙漿利用率及保護(hù)環(huán)境的重要途徑。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是近年來在植物中發(fā)現(xiàn)的N端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，它能夠與(T)(T)TGAC(CT)序列(Wbox)發(fā)生特異性作用，調(diào)節(jié)啟動子中含Wbox元件的調(diào)節(jié)基因或功能基因的表達(dá)，從而參與植物的各種生理生理生化反應(yīng)，最近相關(guān)研究表明某些WRKY基因參與調(diào)控木質(zhì)素的生物合成。本研究根據(jù)基因芯片GSE13

2、990中的數(shù)據(jù)，篩選了一個在木質(zhì)部高表達(dá)的候選基因PtWRKY36并從南林95楊(Populusdeltoidscv.Nanlin95)中克隆了該基因，并對其分子序列、組織表達(dá)模式、亞細(xì)胞定位、轉(zhuǎn)錄活性進(jìn)行了分析，構(gòu)建過表達(dá)載體轉(zhuǎn)化楊樹進(jìn)行功能鑒定，為培育低木質(zhì)素楊樹奠定基礎(chǔ)，通過研究我們主要得出了以下結(jié)果：1.根據(jù)基因芯片GSE13990中的數(shù)據(jù)，篩選了一個在木質(zhì)部高效表達(dá)的候選基因PtWRKY36，利用RTPCR技術(shù)從南林95楊中克

3、隆到了該基因，命名為PtWRKY361。2.序列分析顯示，PtWRKY361基因cDNA全長為1674bp，編碼558個氨基酸，其分子量為6.03KDa，理論等電點(diǎn)6.32，擴(kuò)增的PtWRKY361基因序列與毛果楊數(shù)據(jù)庫公布的PtWRKY36基因序列比對有9個堿基的變化，以及5個氨基酸的改變。PtWRKY361含有兩個WRKY結(jié)構(gòu)域，屬于典型的WRKY蛋白家族第I類.3.組織表達(dá)模式分析顯示，PtWRKY361在南林95楊的根、莖尖、老

4、葉、嫩葉、木質(zhì)部、韌皮部6個組織中均有表達(dá)，其中在木質(zhì)部中的表達(dá)量最高，與GSE13990芯片數(shù)據(jù)中的預(yù)期結(jié)果相同。4.構(gòu)建PtWRKY361與綠色熒光蛋白報告基因GFP的融合表達(dá)載體，煙草瞬時轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)顯示，PtWRKY361GFP融合表達(dá)蛋白在細(xì)胞核細(xì)胞膜與細(xì)胞質(zhì)中都有表達(dá)。5.將PtWRKY361基因與GAL4BD融合，實(shí)驗(yàn)表明，PtWRKY361不能使報告基因表達(dá)，在酵母細(xì)胞中沒有轉(zhuǎn)錄激活活性。6.將PtWRKY361插入到植物雙