荷花NnMYB4轉(zhuǎn)錄因子全長(zhǎng)ORF克隆及功能分析.pdf

1、MYB轉(zhuǎn)錄因子普遍存在于高等植物中，在調(diào)控植物次生壁代謝過程中起重要作用。荷花（Nelumbo nucifera Gaern）是多年生水生植物，也是我國(guó)栽培面積最廣、品種資源最豐富的經(jīng)濟(jì)作物和觀賞植物之一。目前對(duì)荷花分子育種研究尚處于起步階段。本研究從荷花中分離克隆得到一個(gè)R2R3型MYB轉(zhuǎn)錄因子基因，并在擬南芥中對(duì)其功能進(jìn)行驗(yàn)證，旨在了解該基因在植物木質(zhì)素合成中的作用，為進(jìn)一步深入研究MYB轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控植物次生壁發(fā)育的分子機(jī)理以及荷花

2、的遺傳育種改良奠定理論基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下:
　　1.通過BLAST分析從荷花基因組里篩選與擬南芥AtMYB4序列同源性較高的荷花轉(zhuǎn)錄因子基因，根據(jù)其cDNA全長(zhǎng)開放閱讀框（open reading frame，ORF）設(shè)計(jì)特異性引物，以荷花品種‘黑龍江紅蓮’幼葉為材料，通過RT-PCR擴(kuò)增得到全長(zhǎng)ORF，命名為NnMYB4。 NnMYB4基因ORF全長(zhǎng)726 bp，編碼241個(gè)氨基酸，屬于R2R3-MYB轉(zhuǎn)錄因子G4亞組，與擬南芥

3、AtMYB4、菊花CmMYB1、玉米ZmMYB31進(jìn)化關(guān)系較近。
　　2.組織定量結(jié)果表明，NnMYB4基因在荷花根、莖、葉柄、劍葉、幼葉、成熟葉中均有表達(dá)，且在幼葉中表達(dá)量相對(duì)較高，在劍葉中表達(dá)量最低。說明在不同器官組織中，NnMYB4的表達(dá)存在差異。
　　3.構(gòu)建pGBKT7-NnMYB4酵母效應(yīng)表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)入酵母菌株Y2H，先后在單缺培養(yǎng)基SD/-Trp和雙缺培養(yǎng)基SD/-His-Ade上篩選培養(yǎng)，結(jié)果顯示，NnM

4、YB4無(wú)轉(zhuǎn)錄激活活性。
　　4.構(gòu)建pMDC43-GFP-NnMYB4綠色熒光蛋白(Green fluorescent protein，GFP)融合表達(dá)載體，農(nóng)桿菌介導(dǎo)轉(zhuǎn)入洋蔥表皮細(xì)胞中，激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示，NnMYB4蛋白定位于細(xì)胞核上。
　　5.構(gòu)建pMDC43-NnMYB4過表達(dá)載體，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法通過侵染擬南芥花序?qū)⑵滢D(zhuǎn)化擬南芥(Columbia-0，Col-0)，利用潮霉素抗性篩選和RT-PCR鑒定，獲

5、得NnMYB4過表達(dá)轉(zhuǎn)基因株系35S∷NnMYB4-1和35S∷NnMYB4-2。與野生型擬南芥wt相比，轉(zhuǎn)NnMYB4擬南芥植株花序莖變矮，花期延遲，莖木質(zhì)部染色面積較小、染色程度變淺，木質(zhì)素含量顯著降低，說明NnMYB4能抑制植株莖的生長(zhǎng)和木質(zhì)素的合成。過表達(dá)NnMYB4分析結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因擬南芥At4CL1、AtC3H、 AtF5H、AtCOMT1、AtIRX8、AtCesA1、AtCesA7、AtCesA8等木質(zhì)素、纖維素合成關(guān)