青蒿AaWRKY3轉(zhuǎn)錄因子的克隆及功能分析.pdf

1、藥用植物青蒿(Artemisia annua L.)在傳統(tǒng)中藥中使用已有兩千多年的歷史。青蒿素是一種倍半萜內(nèi)酯,作為治療抗氯喹惡性瘧疾青蒿素聯(lián)合療法的主要成分,具有非常重要的作用。植物青蒿是目前世界上唯一獲取青蒿素的天然資源,但其青蒿素含量極低,僅為葉片干重的0.1-0.8％;同時,青蒿具有很強(qiáng)的抗逆境脅迫能力。目前,對于其代謝合成方面的研究較多,而基于其抗脅迫方面的研究較為少見。WRKY轉(zhuǎn)錄因子是植物轉(zhuǎn)錄因子中最大的家族之一,其最典型

2、的特征是具有位于N端可結(jié)合下游DNA的含WRKY氨基酸保守序列的WRKY結(jié)構(gòu)域,該結(jié)構(gòu)域含有約60個氨基酸殘基,同時在C端含有非典型鋅指結(jié)構(gòu)(Cx4–5Cx22–23HxH或 Cx7Cx23HxC)。根據(jù)WRKY轉(zhuǎn)錄因子中WRKY結(jié)構(gòu)域的個數(shù)和所含有的鋅指類型,可以把WRKY轉(zhuǎn)錄因子分為三類:具有兩個WRKY結(jié)構(gòu)域并且鋅指結(jié)構(gòu)的類型為Cx4–5Cx22–23HxH的WRKY蛋白屬于I類,具有一個WRKY結(jié)構(gòu)域且鋅指類型為Cx4–5Cx2

3、2–23HxH的WRKY蛋白為II類,鋅指類型為Cx7Cx23HxC的WRKY蛋白則屬于III類WRKY轉(zhuǎn)錄因子。WRKY轉(zhuǎn)錄因子同DNA序列的W盒TTGAC(T/C)有很強(qiáng)的親和性。WRKY轉(zhuǎn)錄因子發(fā)揮功能既需要保守的WRKY氨基酸序列,也需要WRKY結(jié)構(gòu)域中與鋅原子組成四面體結(jié)構(gòu)的半胱氨酸和組氨酸殘基。一些植物生理反應(yīng)過程包括生物合成途徑的調(diào)節(jié)、激素信號的應(yīng)答、逆境脅迫反應(yīng)的調(diào)控、種皮和腺毛的發(fā)育、植物衰老等都與WRKY轉(zhuǎn)錄因子息息

4、相關(guān)。同時,該類轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)也可能受到傷害、病原菌感染等的強(qiáng)烈誘導(dǎo)。
　　本研究為了探索WRKY轉(zhuǎn)錄因子在青蒿素代謝合成及青蒿逆境脅迫中的功能作用,對克隆獲得的青蒿AaWRKY3基因進(jìn)行了相關(guān)的生物信息學(xué)分析、組織及葉片不同發(fā)育水平表達(dá)分析、酵母單雜交分析及其在激素和脅迫處理下的表達(dá)分析,取得了以下的研究成果：⑴克隆了AaWRKY3基因,并對所獲序列進(jìn)行了生物信息學(xué)分析。AaWRKY3基因ORF可編碼324個氨基酸(AA),分子

5、量為35907.1,等電點(diǎn)pI為8.83。將該基因與擬南芥的74個WRKY轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行序列比對,獲得的分子進(jìn)化樹顯示,AaWRKY3與擬南芥中的AtWRKY18、AtWRKY40和AtWRKY60親緣關(guān)系較近。進(jìn)一步的蛋白序列比對結(jié)果表明,AaWRKY3同AtWRKY18、AtWRKY40和AtWRKY60一樣,屬II類WRKY轉(zhuǎn)錄因子。⑵發(fā)現(xiàn)AaWRKY3基因與青蒿中青蒿素代謝合成的相關(guān)程度較低。實(shí)時熒光定量PCR分析發(fā)現(xiàn),AaWRK

6、Y3在青蒿不同組織及葉片不同發(fā)育時期表達(dá)情況不同,在根中表達(dá)量最高,在葉片中表達(dá)量最低;伴隨著葉片發(fā)育表達(dá)量升高。該表達(dá)模式與所發(fā)現(xiàn)的青蒿素代謝合成關(guān)鍵酶基因如ADS、CYP71AV1及DBR2等的表達(dá)模式不一致。進(jìn)一步的酵母單雜交實(shí)驗(yàn)也顯示,該基因與青蒿中青蒿素代謝合成關(guān)鍵酶基因ADS啟動子的Wa盒不結(jié)合,推測其與青蒿素代謝合成相關(guān)程度較低。⑶發(fā)現(xiàn)AaWRKY3基因受非生物脅迫強(qiáng)烈誘導(dǎo)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn),在激素及脅迫處理下,激素處理可以對Aa