菊花轉(zhuǎn)錄因子CmTGAs的克隆及同源遺傳轉(zhuǎn)化研究.pdf

1、菊花(Chrysanthemum morifolium Ramat.)是原產(chǎn)我國(guó)的傳統(tǒng)花卉，集觀賞、藥用、食用于一體。在生產(chǎn)實(shí)踐中，病害成為影響其產(chǎn)量和品質(zhì)的重要因素，黑斑病是主要病害之一。水楊酸(SA)介導(dǎo)的系統(tǒng)獲得抗性(SAR)能使植物獲得對(duì)病原的廣譜抗性，轉(zhuǎn)錄因子TGA在SA介導(dǎo)的SAR中起重要的調(diào)節(jié)作用。本研究以原產(chǎn)河南省焦作市懷區(qū)的優(yōu)良品種小黃菊(Huaiqingyellow chrysanmemum)為試材，對(duì)其SAR調(diào)節(jié)基

2、因CmTGAs進(jìn)行了系統(tǒng)研究，并對(duì)其黑斑病原菌進(jìn)行了分離純化，取得了如下研究結(jié)果：
　　1.分離到三個(gè)CmTGAs類基因全長(zhǎng)，分別為CmTGA1、CmTGS1、CmPAN。采用Race法克隆到CmTGA1、CmTGA5、CmPAN三個(gè)基因，與已知基因序列進(jìn)行同源性比對(duì)，同源性分別可達(dá)到61％，80％，65％，通過對(duì)編碼區(qū)氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，亮氨酸拉鏈保守區(qū)分別在N端第70-100、40-80、150-195個(gè)氨基酸，D亞族特征

3、序列分別位于N端第340-351、309-321、420-430個(gè)氨基酸。
　　2.構(gòu)建了CmTGAs的過表達(dá)載體、獲得了轉(zhuǎn)化菌株。利用酶切、連接的方法構(gòu)建了轉(zhuǎn)基因載體super1300-GFP-CmTGAs，通過凍融法將super1300-GFP-CmTGAs導(dǎo)入農(nóng)桿菌GV3101中。
　　3.建立了小黃菊的胚狀體高頻再生及受體再生體系。最佳胚狀體誘導(dǎo)培養(yǎng)基組合為MS+1.5 mg/L IAA+0.5 mg/L6-BA+1

4、.0 mg/L2，4-D，最適誘導(dǎo)時(shí)間為10 d，誘導(dǎo)率可達(dá)80％，誘導(dǎo)后在去除2，4-D的分化培養(yǎng)基上，芽的分化率可達(dá)75％。以此為基礎(chǔ)，進(jìn)一步優(yōu)化了受體再生體系，確定以5.0 mg/L潮霉素(HmB)為芽分化選擇壓、4.5 mg/L潮霉素為生根選擇壓、頭孢霉素(Cef.)最適抑菌濃度為100 mg/L。
　　4.進(jìn)行了CmTGA1的同源轉(zhuǎn)化，獲得了抗性植株。將小黃菊葉塊在IM誘導(dǎo)培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)3 d，用搖至OD600=0.5-

5、0.7工程菌侵染10 min，黑暗共培養(yǎng)2 d，在含100 mg/LCef.和1.0 mg/L HmB的IM上，誘導(dǎo)5 d轉(zhuǎn)接到含100 mg/L Cef.和5.0 mg/L HmB的RM分生培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，待愈傷組織分化出不定芽后轉(zhuǎn)到含100 mg/L Cef和10.0 mg/LHmB DM發(fā)育培養(yǎng)基上生長(zhǎng)兩周左右，轉(zhuǎn)到含50 mg/L Cef.和4.5 mg/L HmB RTM生根培養(yǎng)基中進(jìn)行生根篩選培養(yǎng)。共獲得抗性植株23株，18