斜帶石斑魚(yú)(Epinephelus coioides)C-反應(yīng)蛋白基因的克隆、表達(dá)及多克隆抗體制備.pdf

1、本研究利用已構(gòu)建的斜帶石斑魚(yú)(Epinephelus coioides)頭腎Smart cDNA文庫(kù),首次克隆表達(dá)了斜帶石斑魚(yú)C-反應(yīng)蛋白(EC-CRP)基因,并純化獲得了EC-CRP基因表達(dá)蛋白。EC-CRP的cDNA全長(zhǎng)為946bp,其中5'非翻譯區(qū)(5'-UTR)為148bp,3'非翻譯區(qū)(3'-UTR)為123 bp,開(kāi)放閱讀框(ORF)為675bp,編碼225aa。序列同源性分析發(fā)現(xiàn),其氨基酸序列與大西洋鮭(Salmo sal

2、ar)同源性最高,為42.58％。重組表達(dá)蛋白主要以包涵體形式存在,經(jīng)親和層析純化獲得帶His標(biāo)簽的EC-CRP表達(dá)蛋白,SDS-PAGE電泳表明其分子量為25kDa。斜帶石斑魚(yú)CRP表達(dá)蛋白的獲得為其疾病診斷和相關(guān)分子機(jī)理研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 Real-time PCR法研究溶藻弧菌免疫斜帶石斑魚(yú)后CRP基因在不同組織里的表達(dá)水平差異,結(jié)果發(fā)現(xiàn),溶藻弧菌免疫斜帶石斑魚(yú)24h后CRP在斜帶石斑魚(yú)的頭腎、脾臟、肝臟、腎臟、小腸、

3、心臟、鰓、胸腺組織中均有表達(dá),其中頭腎中表達(dá)量最高,肝臟次之,然后依次是腎臟、脾臟、腸、心臟、和腮,胸腺中表達(dá)量最少。隨著斜帶石斑魚(yú)感染時(shí)間的增長(zhǎng),CRP表達(dá)量在各組織達(dá)到峰值的時(shí)間不同:3h時(shí)鰓組織中表達(dá)量達(dá)峰值,為正常值的1.5倍；6h時(shí)胸腺組織中表達(dá)量達(dá)峰值,為正常值的2倍；12h時(shí)脾臟和腎臟組織中表達(dá)量達(dá)峰值,都為正常值的5倍；24h時(shí)頭腎和腸組織中表達(dá)量達(dá)峰值,為正常表達(dá)量的50倍和1.5倍；48h時(shí)肝臟組織到達(dá)到峰值,為正常

4、值的20倍。斜帶石斑魚(yú)在分別含10ppm苯酚、20ppm CdCl2和2ppm CuSO4的海水中暴露,以頭腎組織為模式組織,發(fā)現(xiàn)隨著時(shí)間的增加CRP表達(dá)量逐漸增加,分別在6h、6h、6h及12h處最高,分別為正常表達(dá)量的50倍、30倍和15倍。這些現(xiàn)象說(shuō)明了魚(yú)機(jī)體內(nèi)對(duì)不同污染脅迫解毒緊迫性的必要程度可能有所差別。由于CRP的表達(dá)水平與暴露時(shí)間和污染物的性質(zhì)有較好的關(guān)聯(lián)性,而且隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)與CRP濃度變化的趨勢(shì)具有一致性,因此提示

5、可以作為污染早期效應(yīng)生物標(biāo)志物。
　　 采用了溴化氰活化的Sepharose4B作為親和吸附劑基質(zhì),選用phosphorylcholinechloride calcium作為配體,制得了純化CRP的PC-Sepharose親和層析柱,提取到了的CRP天然蛋白純品。SDS-PAGE分析發(fā)現(xiàn),該蛋白只含有一種亞基,大小約為26kDa,表明斜帶石斑魚(yú)和其他絕大部分魚(yú)類(lèi)一樣,CRP中只含有一類(lèi)亞基。
　　 本研究制備了兔抗CRP