SLA-DOB基因的克隆、原核表達及多態(tài)性研究.pdf

1、主要組織相容性復合體(MajorHistocompatibilityComplex，MHC)指集中于某一染色體、編碼與免疫應答直接相關的一類細胞膜糖蛋白基因群。其功能不僅限于移植排斥反應，它還與機體對外源性抗原的免疫應答之間存在關聯(lián)。近年來，基于MHC基因在器官移植和免疫應答上扮演的重要角色，人們在人、鼠、綿羊、牛、犬等物種上進行了大量的研究。豬SLA-DOB基因是參與SLAⅡ類抗原遞呈的一個重要功能基因，但在國內暫沒有看到對該基因的相

2、關研究報道。有鑒于此，本文以巴馬小型豬、五指山小型豬、滇南小耳豬、合作豬、甘孜藏豬、荷包豬六個品種共137頭豬的耳組織樣以及一頭巴馬小型豬的內臟器官為材料，運用生物信息學手段、RT-PCR、原核表達及SSCP-PCR結合測序等方法對SLA-DOB基因進行了研究，主要包括對該基因序列的獲取、特性分析預測、組織表達及多態(tài)性等方面，為豬免疫應答抗原遞呈和相關基因多態(tài)性信息的后續(xù)研究提供一些有益的參考。主要研究結果如下： 1.以人HLA

3、-DOB基因cDNA序列為信息探針，對豬EST數(shù)據(jù)庫進行同源檢索篩選，克隆了豬SLA-DOB1基因的cDNA序列，片段全長897bp。通過NCBI的ORFfinder服務器對所獲得的cDNA序列進行開放閱讀框架(ORF)分析，結果發(fā)現(xiàn)其開放閱讀框架推測編碼277個氨基酸。為了驗證電子克隆序列的正確性，在其起始密碼子區(qū)域和終止密碼區(qū)域設計特異引物，經(jīng)RT-PCR進行克隆、序列分析驗證，結果表明與電子克隆序列完全一致(GenBank登錄號為

4、DQ333334)。通過序列同源比對及系統(tǒng)發(fā)育進化分析，發(fā)現(xiàn)克隆到的序列與其它物種DOB基因具有很高的同源性。應用生物信息學的方法對SLA-DOB1基因編碼氨基酸進行蛋白質基本性質、結構及功能預測，結果顯示SLA-DOB1分子是一種具有信號肽序列，靠近N端末端存在一個跨膜結構的MHCⅡ類β分子前體蛋白。多序列同源比對發(fā)現(xiàn)，SLA-DOB1與小鼠、牛、兔子、綿羊、犬、黑猩猩、人的DOB核酸序列的同源性分別為71％、77％、69％、79％、

5、76％、77％、78％；與小鼠、牛、綿羊、犬、黑猩猩、人的DOB氨基酸序列的同源性分別為67％、76％、80％、78％、67％、76％。構建SLA-DOB1基因的分子進化樹進一步揭示了豬與其它哺乳動物的進化關系。 2.本研究構建了SLA-DOB1基因全編碼序列的原核表達質粒，并進行了表達研究。將克隆在pMD18-T載體上的SLA-DOB1基因全編碼序列(834bp)插入原核表達載體pMAL-C2X，得到重組質粒pMAL-C2X-

6、DOB1，轉化大腸桿菌TB1(表達菌株)，IPTG誘導裂解菌體作SDS-PAGE分析，粗略得到融合表達蛋白特異條帶，該表達條帶的大小為75.8KDa(SLA-DOB1蛋白質為32.3KDa，菌蛋白為42.5KDa)。 3.巢式PCR檢測SLA-DOB1基因在心、肝、脾、回腸、腎、胸腺、淋巴結中表達。其中，該基因在脾臟、胸腺以及淋巴結中高度表達，其次在心臟、回腸、腎臟和肝臟中有表達，而在肌肉中沒有任何表達。 4.通過比對出

7、的外顯子區(qū)域設計了三對引物擴增出SLA-DOB的內含子1、2、3三個DNA片段，長度分別為571bp、663bp和804bp。根據(jù)內含子序列又設計了兩對引物擴增出SLA-DOB的外顯子2、3區(qū)域，長度分別為291bp和334bp。對DOB基因的外顯子2、3通過SSCP的方法對6品種豬群共137個體進行了群體多態(tài)性研究，發(fā)現(xiàn)SLA-DOB第2外顯子高度保守，而外顯子3基于個體PCR-SSCP和菌落PCR-SSCP鑒別了10種等位基因，通過