長江草魚群體MHC ClassⅡB基因的克隆、表達(dá)及多態(tài)性分析.pdf

1、主要組織相容性復(fù)合體(majorhistocompatibilitycomplex，MHC)是在脊椎動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)的編碼免疫球蛋白樣受體的高度多態(tài)的基因群，并且其某些基因型與生物體抗病能力存在一定的關(guān)聯(lián)關(guān)系。本研究以我國重要淡水養(yǎng)殖經(jīng)濟(jì)魚類草魚為實(shí)驗(yàn)材料，利用PCR、RT-PCR等技術(shù)研究了MHCⅡB基因的克隆、表達(dá)、等位基因的多態(tài)性以及等位基因的多態(tài)性與魚體抗病力之間的關(guān)系，為篩選抗病相關(guān)MHCⅡB基因標(biāo)記和建立基因標(biāo)記輔助選育技術(shù)提供基

2、礎(chǔ)。
　　 (1)克隆及測序了草魚長江3個(gè)群體的主要組織相容性復(fù)合體(MHC)ClassⅡB基因編碼β1和β2區(qū)的第2和第3個(gè)外顯子及兩個(gè)外顯子之間的內(nèi)含子，分析了草魚MHC的進(jìn)化模式和種群遺傳結(jié)構(gòu)。結(jié)果共定義了34個(gè)等位基因，每條序列包括長為130～136bp的第2個(gè)外顯子，長為218bp的第3個(gè)外顯子以及長81～371bp的內(nèi)含子。序列分析揭示，第2個(gè)外顯子有106個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)(78％)和40個(gè)氨基酸變異位點(diǎn)(88％)，

3、而第3個(gè)外顯子有100個(gè)核苷酸變異位點(diǎn)(45％)和41個(gè)氨基酸變異位點(diǎn)(56％),β1變異要大于β2區(qū)。用鄰接法(NJ)分別構(gòu)建的βi和β2序列系統(tǒng)樹均獲得5個(gè)高支持率的譜系，結(jié)合序列變異特點(diǎn)和內(nèi)含子長度，推測草魚至少存在5個(gè)MHCClassⅡ座位。分別計(jì)算βi的肽結(jié)合位點(diǎn)(PBR)、非肽結(jié)合位點(diǎn)及β2的非同義替換率(dN)和同義替換率（ds），結(jié)果顯示PBR的dN/dS為2.03(p＜0.05)，非肽結(jié)合位點(diǎn)和β2則小于1，表明草魚M

4、HC受到歧化選擇作用。根據(jù)不同群體中MHC等位基因分布頻率的分子方差分析(FST=0.37％)，長江草魚群體間無遺傳分化。
　　 (2)用嗜水氣單胞菌感染健康草魚，分別在感染5h、16h、40h、64h、88h、112h時(shí)收集草魚各組織材料提取總RNA，另取健康草魚組織作對(duì)照。以反轉(zhuǎn)錄合成的第一鏈cDNA為模板，應(yīng)用RT-PCR半定量檢測方法對(duì)草魚感染嗜水氣單胞菌前后的MHCⅡB基因組織表達(dá)特點(diǎn)進(jìn)行了研究。結(jié)果表明，在正常草魚組

5、織中，除腦組織以外，MHCⅡB基因均擴(kuò)增出約350bp的片段，MHCⅡB基因較強(qiáng)的表達(dá)于腎臟、心臟和腸中，中等程度表達(dá)于肝臟、脾臟和鰓中，在肌肉中表達(dá)最弱。嗜水氣單胞菌感染后，在草魚的肝臟、腎臟、心臟、腸和鰓組織中，感染初期MHCⅡB基因表達(dá)量都有所下降，而在感染88h的時(shí)候MHCⅡB基因表達(dá)量在所有時(shí)間點(diǎn)中達(dá)到最大，感染112h后表達(dá)量慢慢回落至正常值；其中腸組織在112h時(shí)，MHCⅡB基因表達(dá)水平依舊較高。脾臟在感染后，表達(dá)量總體處