豬Cst B基因的克隆、多態(tài)性分析及表達(dá)規(guī)律的研究.pdf

1、人們用候選基因法已確定Cst B基因是影響肌肉柔軟的候選基因。Cst B是半胱氨酸蛋白酶抑制劑家族(cystatin)成員之一，cystatin是溶酶體半胱氨酸蛋白酶(如組織蛋白酶B、H、L和S等)的內(nèi)源性抑制劑，由一個(gè)大的超家族組成，包括A、B、C等數(shù)種。cystatin B(又稱stefin B，STFB)主要抑制組織蛋白酶L，通過控制細(xì)胞內(nèi)溶酶體蛋白酶的活性從而調(diào)控蛋白轉(zhuǎn)換和酶原、激素原的加工。干制火腿的極度松軟與其加工過程中的高

2、蛋白酶解水平有關(guān)，并表現(xiàn)出其他一些缺點(diǎn)，如粘性咀嚼、顏色發(fā)黑、有澀味和金屬味、長(zhǎng)期的酪氨酸結(jié)晶以及在切口表面形成的白色膜狀物。在火腿的加工過程中，蛋白質(zhì)的降解大部分都是由肌質(zhì)和肌漿中的溶酶體蛋白酶催化的。這些溶酶體蛋白酶的主要代表是組織蛋白酶B、H、L和D，這些酶在豬的成熟階段都是有活力的，然而半胱氨酸蛋白酶抑制劑B(Cystatins B)可以降低這些酶的功能。本研究克隆得到了豬的Cst B基因的全cDNA序列，并對(duì)其進(jìn)行了多態(tài)性及分

3、子進(jìn)化方面的分析，采用RT-PCR和Western blot方法構(gòu)建了mRNA水平和蛋白水平的表達(dá)圖譜，采用RT-PCR方法研究了Cst B基因在不同日齡大白豬、野家雜種豬和360日齡的不同個(gè)組織中mRNA水平的表達(dá)規(guī)律。 主要研究結(jié)果如下： (1).利用RT-PCR及RACE等方法，首次克隆了豬的Cst B基因全cDNA序列； (2).對(duì)豬的Cst B基因克隆測(cè)序結(jié)果發(fā)現(xiàn)兩個(gè)突變位點(diǎn)：第3外顯子區(qū)內(nèi)第19個(gè)堿基

4、處，突變?yōu)镚→A；第2內(nèi)含子區(qū)內(nèi)第88個(gè)堿基處，突變?yōu)镚→A。并且對(duì)這兩個(gè)位點(diǎn)進(jìn)行了多態(tài)性分析； (3).構(gòu)建Cst B基因的分子進(jìn)化樹； (4).利用半定量RT-PCR，構(gòu)建了不同日齡的大白豬、野家雜種豬和360日齡野豬不同組織mRNA水平的表達(dá)圖譜；利用Western blot方法，構(gòu)建了360日齡大白豬、360日齡野家雜種豬和360日齡野豬不同組織蛋白水平的表達(dá)圖譜； (5).對(duì)Cst B基因在同-日齡大白