綿羊MHC class I區(qū)段部分BAC克隆基因組成與結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、目的：以中國美利奴羊BAC文庫中含有MHC片段的346G21及239C1克隆為材料通過酶切、末端標記制備放射性DNA探針，與已構(gòu)建的中國美利奴羊cDNA文庫進行噬菌體原位雜交以篩選含有MHC class I區(qū)段基因序列的目的克隆，通過對篩選出的目的克隆進行測序及生物信息學(xué)分析，研究346G21及239C1克隆所在區(qū)段中基因的組成及結(jié)構(gòu)。
　　 方法：
　　 (1)中國美利奴羊BAC文庫中含有MHC片段的346G21及23

2、9C1陽性克隆進行測序，利用GENSCAN基因預(yù)測工具（New GENSCAN Web Server at MIT）預(yù)測該克隆可能包含的基因，以該克隆為材料進行酶切，利用Taq DNA聚合酶進行放射性末端標記。利用標記好的放射性DNA探針進行噬菌體原位雜交，篩選中國美利奴羊cDNA文庫，通過放射自顯影技術(shù)獲得目的克隆。
　　 (2)對獲得的噬菌體單克隆，利用試劑盒提供的XLOLR菌和Helper Phage將獲得的噬菌體單克隆的

3、插入片段轉(zhuǎn)化至pBK-CMV載體，保存于XLOLR菌體中，提取轉(zhuǎn)化后的載體質(zhì)粒進行酶切鑒定。通過對目的克隆進行測序及生物信息學(xué)分析,研究346G21及239C1 BAC克隆中基因的組成進而分析該區(qū)段的基因結(jié)構(gòu)。
　　 結(jié)果：本研究對MHC ClassⅠ區(qū)段的BAC探針雜交篩選美利奴細毛羊cDNA文庫的實驗中32P末端標記探針的制備方法進行了改進，采用Taq DNA聚合酶替代Klenow Fragment進行末端標記，并驗證了該方

4、法適用于本實驗。利用標記后的探針對探針的陽性對照DNA片段進行雜交，探討了放射性雜交條件及雜交完成后游離探針的洗脫條件，初步判定了雜交篩選cDNA文庫的條件。通過噬菌體原位雜交篩選得到了27個陽性克隆，并對其進行了測序及生物信息學(xué)分析。
　　 結(jié)論：所制備的32P標記DNA探針適用于噬菌體原位雜交篩選cDNA文庫，為cDNA文庫的高通量篩選提供了一個簡易的放射性探針制備及雜交篩選平臺。篩選得到的cDNA單克隆經(jīng)過測序分析，測序結(jié)