櫛孔扇貝(Chlamys farreri)BAC文庫的構(gòu)建及其基因組特征分析.pdf

1、櫛孔扇貝（Chlamys farreri）是我國北方沿海一種重要的經(jīng)濟(jì)貝類，在我國水產(chǎn)養(yǎng)殖產(chǎn)業(yè)中占有重要的位置。開展櫛孔扇貝的基因組學(xué)研究，對于了解重要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳學(xué)基礎(chǔ)，開發(fā)重要經(jīng)濟(jì)性狀的遺傳調(diào)控基因，從而指導(dǎo)品種改良和遺傳育種具有重要意義。本研究首先構(gòu)建了一個櫛孔扇貝基因組學(xué)研究平臺，此平臺包含三個細(xì)菌人工染色體（BAC）文庫，而后實現(xiàn)了文庫的初步應(yīng)用分析。與此同時，利用高通量測序技術(shù)將櫛孔扇貝全基因組進(jìn)行測序評估，并由此對基因組

2、特征進(jìn)行初步分析。本篇論文主要包括以下三部分內(nèi)容：
　　1.櫛孔扇貝BAC文庫的構(gòu)建及質(zhì)量評價
　　本研究構(gòu)建了櫛孔扇貝三個BAC文庫，分別為BamHI文庫，HindIII文庫和Sau3AI文庫，其中BamHI文庫包含34,560個克隆，平均插入片段為98Kb，未發(fā)現(xiàn)空載；HindIII文庫包含132,480個克隆，平均插入片段為106Kb，空載率為1.67％；Sau3AI文庫包含23,040個克隆，平均插入片段為53Kb，

3、空載率為3.33%。三個文庫總共由190,080個克隆組成，平均插入片段為98Kb，覆蓋櫛孔扇貝基因組的15.4倍。隨機(jī)挑選BAC克隆100代的繼代培養(yǎng)，沒有發(fā)現(xiàn)插入片段的丟失或重排現(xiàn)象，說明所構(gòu)建的BAC文庫是穩(wěn)定的。將所有克隆進(jìn)行超級池及二級池的構(gòu)建，篩選了櫛孔扇貝3個基因以及遺傳圖譜上的7個微衛(wèi)星標(biāo)記，陽性克隆數(shù)在6-18之間，表明這三個文庫可以在目的基因或標(biāo)記的篩選，物理圖譜構(gòu)建以及大規(guī)?；蚪M測序過程中發(fā)揮重要作用。
　

4、　2.櫛孔扇貝BAC文庫的應(yīng)用
　　本研究選取櫛孔扇貝8個免疫相關(guān)候選基因及17個與生長性狀QTL連鎖的SNP標(biāo)記為研究對象，利用BAC文庫的4D-PCR篩選系統(tǒng)對這25個位點進(jìn)行篩選分析，每個位點篩選出3個陽性克隆，最終獲得了75個含有目的基因或SNP標(biāo)記的陽性克隆。這為日后櫛孔扇貝免疫及生長性狀相關(guān)基因的完整克隆奠定了基礎(chǔ)。另外，還利用BAC-FISH技術(shù)對櫛孔扇貝Toll樣受體（TLR）信號通路中的關(guān)鍵基因（CfTLR,Cf

5、Myd88,CfTRAF6,CfNFκB和CfIκB）進(jìn)行染色體定位。結(jié)果顯示，包含這些基因的5個BAC克隆定位在染色體上的位置單一。進(jìn)一步通過核型分析及共定位驗證，這5個克隆被定位于5對不同的染色體上，表明TLR信號通路的5個關(guān)鍵基因在櫛孔扇貝基因組中并不連鎖。這些研究對探索櫛孔扇貝免疫系統(tǒng)機(jī)理有著積極的作用，并有利于細(xì)胞染色體分析等工作的開展。
　　3.櫛孔扇貝基因組勘探測序及特征分析
　　本研究采用全基因組鳥槍法策略，

6、依托于Illumina solexa高通量測序平臺對櫛孔扇貝基因組進(jìn)行勘探測序，獲得了62.44Gb的有效數(shù)據(jù)，評估覆蓋深度約為50X。對所有短序列組裝結(jié)果顯示contig N50為1,267bp，scaffold N50為1,517bp，獲得scaffold總長約為870Mb。通過17-kmer分析估計櫛孔扇貝基因組大小約為971Mb，并預(yù)測該測序個體的雜合度約為1.35%。對scaffold序列進(jìn)行初步分析，估計其覆蓋真實基因組的5

7、7.1%，覆蓋轉(zhuǎn)錄組的88.7%。運用RepeatMasker軟件進(jìn)行掃描，獲得了884,644個散在重復(fù)序列，主要分為四種類型：DNA轉(zhuǎn)座子、SINE反轉(zhuǎn)座子、LINE反轉(zhuǎn)座子和LTR反轉(zhuǎn)座子。其中，DNA轉(zhuǎn)座子數(shù)目最多，其次是SINE反轉(zhuǎn)座子、LINE反轉(zhuǎn)座子和LTR反轉(zhuǎn)座子。運用SciRoKo軟件進(jìn)行掃描，獲得了134,887個微衛(wèi)星序列，分為437種類型，其中單堿基重復(fù)的微衛(wèi)星數(shù)目最多。這些結(jié)果的獲得將有利于對櫛孔扇貝基因組結(jié)構(gòu)