雞MHC Iα基因直核表達(dá)系統(tǒng)的建立與鑒定.pdf

1、主要組織相容性復(fù)合體(Majorhistocompatibilitycomplex，MHC)在免疫應(yīng)答中起重要作用。雞的主要組織相容性復(fù)合體I(BF)又名B復(fù)合體，位于16號(hào)染色體，由主基因座(BF2)和次基因座(BF1)組成。雞的B-F區(qū)的基因編碼與哺乳動(dòng)物同源的MHCI類分子。MHCI類分子主要負(fù)責(zé)遞呈內(nèi)源性抗原肽，被CD8+T細(xì)胞識(shí)別。雞BF2基因編碼的MHCI類分子α鏈在遞呈內(nèi)源性抗原中起重要作用。由于MHC在動(dòng)物機(jī)體免疫系統(tǒng)中

2、的重要作用而成為抗病能力的候選標(biāo)記基因。MHC的特殊性質(zhì)及其重要的功能，使得其在免疫遺傳學(xué)、群體遺傳學(xué)和抗病育種學(xué)等許多領(lǐng)域具有獨(dú)特的效力。人和鼠等哺乳動(dòng)物的MHC分子結(jié)構(gòu)和功能的研究較多，而雞的MHC分子研究相對(duì)較落后，尤其是MHCI類分子。為了對(duì)雞的MHCI類分子的進(jìn)一步研究，本試驗(yàn)構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)雞MHCI類分子α基因的P815細(xì)胞株。
　　 首先，本研究根據(jù)GenBank登錄的雞MHCIα基因全序列(GenBank登錄號(hào)：A

3、Y989897)和pEGFP-N1的多克隆位點(diǎn)序列，設(shè)計(jì)一對(duì)引物。從雞的外周血單核細(xì)胞抽提mRNA，作為RT-PCR擴(kuò)增MHCIα基因片段的模板。通過大量PCR獲得雞MHCIα基因片段，將其插入能夠表達(dá)綠色熒光蛋白的載體pEGFP-N1獲得真核重組質(zhì)粒pEGFP-N1-MHCIα。經(jīng)過用卡那霉素的篩選，以及EcorI、SalI雙酶切和PCR初步鑒定正確后，送上海生工進(jìn)行測序鑒定。
　　 其次，為了了解哺乳動(dòng)物MHCIα和禽類MH

4、CIα之間的區(qū)別和聯(lián)系，我們通過生物信息學(xué)對(duì)雞、鵪鶉、鴨、小鼠、人、牛進(jìn)行序列比對(duì)和繪制進(jìn)化樹，結(jié)果表明禽類與哺乳類MHCIα鏈在進(jìn)化上屬于不同的分支，鵪鶉與雞的親緣距離最近，其次是鴨，小鼠、人、牛則為一類。進(jìn)行雞、鴨、鼠、人蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測發(fā)現(xiàn)它們具有高度的結(jié)構(gòu)相似性，因此我們推測它們的功能也是極為類似的。通過軟件對(duì)雞的MHCIα編碼的蛋白進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位預(yù)測，結(jié)果是蛋白分布于內(nèi)膜系統(tǒng)。
　　 最后，將重組質(zhì)粒pEGFP-N1-MH

5、CIα轉(zhuǎn)染COS-7細(xì)胞，觀察MHCIα的瞬時(shí)表達(dá)特性和細(xì)胞定位情況，經(jīng)24h培養(yǎng)后在熒光顯微鏡下觀察，MHCIα基因表達(dá)的雞MHCI類分子的α鏈定位于內(nèi)膜系統(tǒng)，結(jié)果和預(yù)測的一樣即蛋白表達(dá)在內(nèi)膜系統(tǒng)。通過試驗(yàn)確定G418工作濃度，在P815細(xì)胞密度為70％-90％時(shí)，將pEGFP-N1-MHCIα重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到P815細(xì)胞中，然后進(jìn)行篩選獲得了抗600μg/mlG418的P815細(xì)胞株。經(jīng)過RT-PCR的鑒定，表明MHCIα已穩(wěn)定的在P

6、815中穩(wěn)定表達(dá)。經(jīng)過反復(fù)凍存、復(fù)蘇，傳代培養(yǎng)。P815(pEGFP-N1-MHCIα)細(xì)胞仍保持G418抗性，RT-PCR檢測陽性，表明所得到P815(pEGFP-N1-MHCIα)細(xì)胞株具有穩(wěn)定性，適用于下游實(shí)驗(yàn)。用熒光顯微鏡進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)P815的pEGFP-N1-MHCIα的熒光定位于細(xì)胞的內(nèi)膜系統(tǒng)。在前人的研究基礎(chǔ)以及預(yù)測結(jié)果和實(shí)驗(yàn)結(jié)果我們可確定雞MHCIα定位于細(xì)胞的內(nèi)膜系統(tǒng)。
　　 本實(shí)驗(yàn)成功構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pEGF