雞毒支原體套式PCR檢測方法的建立及其mgc2基因的原核表達(dá).pdf

1、雞毒支原體（Mycoplasma Gallisepticum，MG）感染是危害養(yǎng)禽業(yè)重要的呼吸道傳染病之一，由于MG通常與其他呼吸道病原混合感染，給臨床MG感染的診斷帶來困難。為探討MG黏附蛋白的反應(yīng)原性，建立一種特異性好、敏感性高的診斷MG感染的方法，本研究以肉雞雞毒支原體感染為研究對象，分離鑒定病原并建立了套式PCR診斷方法；同時對黏附蛋白mgc2進(jìn)行克隆與表達(dá)分析。
　　方法：采集發(fā)生自然感染的呼吸道疾病的肉雞的肺臟、氣囊、

2、氣管分泌物，實驗室進(jìn)行病原的分離培養(yǎng)，通過對病原的初步鑒定（L型細(xì)菌鑒定、菌落形態(tài)觀察、染色鏡檢、紅細(xì)胞吸附試驗）、PCR擴增與測序等方法進(jìn)行MG病原鑒定；并對目前常用的5對引物(gapA-F/gapA-R、16s rRNA-F/16s rRNA-R、mgc2-F1/mgc2-R1、mgc2-F2/mgc2-R2、LP-F/LP-R)進(jìn)行靈敏性比較，篩選出靈敏度最高的引物建立套式PCR檢測方法，同時對其特異性、敏感性進(jìn)行檢測；最后對MG

3、的黏附蛋白mgc2進(jìn)行克隆與原核表達(dá)，采用Western blot分析是否具有反應(yīng)原性。
　　結(jié)果：
　?。?）MG分離與鑒定：試驗共分離出36株MG菌株。其中有3株來自MG單純感染病例，從3～20日齡的肉雞場分離得到，33株來自MG混合感染病例，從21～40日齡的肉雞場分離得到。
　?。?）MG套式PCR檢測結(jié)果：通過比較5對引物對MG的靈敏度，可得以mgc2基因設(shè)計的引物靈敏度最高，能檢測出的MG的最低濃度為57.

4、6 pg/μL，用此引物建立的套式PCR檢測方法能夠擴增基因片段大小為300 bp，與GenBank收錄的相關(guān)序列同源性為98％，而與大腸桿菌、沙門氏菌、雞滑液囊支原體均無交叉反應(yīng)，能夠檢測出DNA的最小量為0.18 fg/μL。通過對安徽、山東省部分地區(qū)疑似MG的50只病死雞進(jìn)行檢測，陽性檢出率為80%。
　?。?）雞毒支原體的黏附蛋白mgc2原核表達(dá)結(jié)果：將mgc2基因序列中一個編碼Trp的密碼子TGA成功突變?yōu)門GG，突變后