雞毒支原體伴侶蛋白GroEL生物活性檢測(cè)及免疫特性研究.pdf

1、雞毒支原體（Mycoplasmagallisepticum，MG）是一種能引起家禽發(fā)生高致病性慢性呼吸道疾病的病原體。該病原體主要利用疫苗進(jìn)行控制，目前常使用滅活的病原體或弱毒菌株。但它們?nèi)源嬖跐撛诘奈ｋU(xiǎn)，滅活不完全的病原體可以直接致病，弱毒苗也存在毒力返強(qiáng)的危險(xiǎn)。免疫蛋白組學(xué)的出現(xiàn)為更加理性的設(shè)計(jì)疫苗提供了可能。由于支原體多種膜蛋白具有強(qiáng)的免疫原性，若直接用全菌蛋白進(jìn)行免疫蛋白組學(xué)研究，大量胞漿蛋白可能混跡其中，這些蛋白一般難以刺激機(jī)

2、體產(chǎn)生具有保護(hù)效價(jià)的抗體，從而使得后續(xù)分析變得異常復(fù)雜。因此，本研究擬利用免疫蛋白組學(xué)篩選MG膜相關(guān)蛋白中具有較好免疫原性的抗原。這對(duì)于尋找新的MG疫苗候選抗原具有著重要的理論和實(shí)際價(jià)值。
　　 (1)雞毒支原體Rlow株膜蛋白的免疫蛋白組學(xué)研究
　　 常規(guī)提取MGRlow株的膜蛋白，運(yùn)用免疫蛋白組學(xué)方法，篩選出與MGRlow株兔多克隆抗體和雞多克隆抗體血清呈雙陽(yáng)性反應(yīng)的蛋白點(diǎn)，將蛋白從對(duì)應(yīng)膠中切出，進(jìn)行MALDI-TO

3、F-MS分析。結(jié)果共鑒定出14種免疫原性蛋白，還有兩種蛋白無(wú)法鑒定，通過(guò)BLAST比對(duì)，這些蛋白在不同支原體中的同源性都非常高。這14種蛋白中，EF-TU，丙酮酸脫氫酶系E2在支原體中已有報(bào)道其具有免疫原性;GroEL、DnaK和磷酸甘油變位酶(PGM)在其他細(xì)菌中已被證實(shí)其具有免疫原性;翻譯延伸因子(greA)、支鏈a-酮酸脫氫酶E2、丙酮酸脫氫酶系E1α亞基及Triggerfactor都有其相關(guān)功能的研究，但至今還沒(méi)有其免疫原性方面

4、的報(bào)導(dǎo);其余四種蛋白未見任何報(bào)導(dǎo)。本實(shí)驗(yàn)首次通過(guò)免疫蛋白組學(xué)方法對(duì)MG膜蛋白進(jìn)行分析，獲得的免疫原性蛋白為下一步進(jìn)行MG亞單位疫苗研究和致病性研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 (2)GroEL蛋白的生物活性檢測(cè)
　　 為了驗(yàn)證雞毒支原體的GroEL是否具有其他細(xì)菌中GroEL的生物學(xué)功能，本研究克隆并表達(dá)了MGRlow株groEL基因，對(duì)表達(dá)產(chǎn)物的ATP酶活性、復(fù)性功能及抗熱應(yīng)激活性進(jìn)行研究。結(jié)果證明，MGGroEL蛋白屬于保守的

5、熱休克蛋白，具有ATP酶活性，有蛋白復(fù)性功能并且具有抗熱應(yīng)激活性。
　　 (3)雞毒支原體GroEL蛋白免疫特性研究
　　 多種病原微生物GroEL蛋白都具有免疫原性。為評(píng)估MGGroEL蛋白的免疫保護(hù)性，本研究首先檢測(cè)GroEL抗體的殺菌活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn):GroEL抗體具有明顯的殺菌活性(48.9％)，將GroEL純化蛋白作為亞單位疫苗接種SPF雞，利用雞毒支原體強(qiáng)毒株Rlow進(jìn)行攻毒，檢測(cè)指標(biāo)包括:存活率、病原分離、氣