復(fù)方慢呼抗抗雞毒支原體藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制的研究.pdf

1、雞毒支原體(Mycoplasma.gallisepticum，MG)是一種可引起雞慢性呼吸道病(Chronicrespiratory disease，CRD)的病原菌，感染此病原菌可增加雛雞的弱雛率，降低蛋雞的產(chǎn)蛋率，減少肉雞體重并延長其上市期，降低飼料的轉(zhuǎn)化率等，使養(yǎng)雞業(yè)遭受巨大的經(jīng)濟損失。復(fù)方中獸藥復(fù)方慢呼抗由黃芩、金銀花、百部、紫菀和甘草五味中藥組成，現(xiàn)已被證實對治療雞毒支原體病有良好的療效，并且毒副作用小、不易產(chǎn)生耐藥性，具有很

2、好的開發(fā)潛力。但由于復(fù)方慢呼抗藥效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確，無法進一步開展其作用機制、體內(nèi)生物轉(zhuǎn)化及代謝過程的研究，不僅導致復(fù)方慢呼抗缺乏可靠的藥理學、毒理學研究數(shù)據(jù)，而且難以建立可控可評的質(zhì)量標準，大大限制了復(fù)方慢呼抗在臨床中的應(yīng)用。因此，闡明復(fù)方慢呼抗藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，不僅可揭示其應(yīng)用的科學內(nèi)涵，而且在此基礎(chǔ)上可建立全面的質(zhì)量控制體系，從而有利的保證復(fù)方慢呼抗質(zhì)量的均一、穩(wěn)定，進一步保證了臨床療效的可重現(xiàn)性，亦為復(fù)方慢呼抗作用機制的研究及其“二

3、次開發(fā)”打下基礎(chǔ)。
　　 本文首先構(gòu)建了復(fù)方慢呼抗的體外指紋圖譜，從宏觀的角度來評價復(fù)方慢呼抗整體的質(zhì)量，并用同樣的色譜條件建立了血清指紋圖譜，通過體外指紋圖譜與血清指紋圖譜的比對，確定了復(fù)方慢呼抗體內(nèi)直接作用的物質(zhì)基礎(chǔ)；同時進行了體外抗雞毒支原體的藥效學試驗，將指紋圖譜特征峰的峰面積和藥效學數(shù)據(jù)進行灰色關(guān)聯(lián)度分析，確定了復(fù)方慢呼抗抗雞毒支原體的關(guān)鍵藥效組分；建立了關(guān)鍵藥效組分的定量方法，用微觀的定量分析彌補指紋圖譜質(zhì)量控制的不

4、足，從而建立了宏觀指紋圖譜與藥效組分定量分析相結(jié)合的復(fù)方慢呼抗質(zhì)量控制的新方法。本研究取得如下幾方面的成果：
　　 1.復(fù)方慢呼抗指紋圖譜的構(gòu)建及模式分類研究
　　 采用HPLC法對不同批次的復(fù)方慢呼抗樣品進行分析，對色譜條件(如色譜柱、檢測波長、流動相系統(tǒng)、沈脫梯度等)進行了優(yōu)化，完成了系統(tǒng)的方法學考察，構(gòu)建了復(fù)方慢呼抗HPLC指紋圖譜。應(yīng)用“中藥色譜指紋圖譜相似性評價系統(tǒng)2004A版”對復(fù)方慢呼抗HPLC指紋圖譜進行

5、了相似度評價，并借助于SPSS11.5軟件對量化的指紋特征(色譜峰峰面積)進行了聚類分析及主成分分析，結(jié)果證明三種分析方法具有很好的一致性，可有效地對復(fù)方慢呼抗指紋圖譜進行評價。此外，還應(yīng)用建立的色譜條件對復(fù)方慢呼抗與各組成藥的相關(guān)性進行了分析，通過與指紋圖譜進行比對，確定了指紋圖譜共有峰的來源。在實際應(yīng)用時，只需將待測樣品按本研究所述的色譜條件進行分析，將量化指紋特征數(shù)據(jù)輸入計算機進行運算，就能快速得出評價結(jié)果，這對于復(fù)方慢呼抗質(zhì)量控

6、制的研究具有重要的理論意義和實用價值。
　　 2.復(fù)方慢呼抗血漿指紋圖譜的建立及血中移行成分分析
　　 在已建立的復(fù)方慢呼抗指紋圖譜基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化含藥血漿的前處理條件，建立了復(fù)方慢呼抗血漿指紋圖譜。針對不同時間點的移行成分。運用HPLC-DAD方法對復(fù)方慢呼抗提取液、給藥血漿和空白血漿進行對比分析。結(jié)果顯示：在給藥后15min入血成分較少，僅有11號峰較明顯；30min出現(xiàn)入血原形成分最多；60min時，一些入血成分減

7、弱或消失，同時有6個代謝產(chǎn)物產(chǎn)生；在120min第2號峰被檢出并且有較高的響應(yīng)值，其他峰減弱或消失。通過血清藥物化學的研究，可以確定指紋圖譜中的共有峰絕大部分均可被吸收入血，是復(fù)方慢呼抗體內(nèi)直接作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 3.復(fù)方慢呼抗指紋圖譜特征與藥效關(guān)系的研究
　　 由于甘草對復(fù)方慢呼抗指紋圖譜共有峰無貢獻，故舍去甘草，將其他4味藥重新組方研究其譜效關(guān)系。以原處方量的0.5，1，1.5倍量作為3個考察水平，以方中4味藥為

8、考察因素，以L9(34)正交表進行藥量的加減試驗。將各組樣品分別進行指紋圖譜分析和體外抗雞毒支原體的藥效學試驗，在獲得復(fù)方慢呼抗指紋圖譜與藥效學量化數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上，采用灰關(guān)聯(lián)度分析技術(shù)，尋找指紋圖譜特征峰所代表的化學成分對藥效貢獻的大小。結(jié)果表明復(fù)方慢呼抗抗雞毒支原體的作用是其“化學成分群”共同作用的結(jié)果。并且根據(jù)關(guān)聯(lián)度的大小，綠原酸、4號峰(未鑒定)、黃芩營、漢黃芩苜對“抗雞毒支原體”活性的貢獻最大。
　　 4.復(fù)方慢呼抗指紋圖

9、譜中綠原酸、黃芩苷、漢黃芩苷的含量測定
　　 由于復(fù)方慢呼抗中的綠原酸、黃芩苷、漢黃芩苷與抗雞毒支原體活性的關(guān)聯(lián)度較大，他們的含量在一定程度上可反應(yīng)復(fù)方慢呼抗的質(zhì)量優(yōu)劣。因此，本試驗采用指紋圖譜的色譜條什，以三種成分最大吸收波長作為檢測波長，對三種活性成分進行了方法學考察并同時測定各成分的含量。結(jié)果表明方法學考察中各項試驗結(jié)果的RSD均小于3％，表明儀器精密度高、方法的重復(fù)性好，并具有良好的回收率利穩(wěn)定性。復(fù)方慢呼抗提取物中三種

10、成分的含量為別為(1.53±0.03)％、(10.93±0.27)％、(4.476±0.11)％。建立的三種成分同時測定方法，不僅使定量分析更加簡便、快捷，并且可以彌補指紋圖譜存定量控制方面的不足，二者結(jié)合可以更有效、全面的控制復(fù)方慢呼抗的質(zhì)量。
　　 5.復(fù)方慢呼抗提取工藝的研究
　　 黃芩苷、漢黃芩苷、綠原酸已被確定為復(fù)方慢呼抗抗雞毒支原體的關(guān)鍵組分，引入總評“歸一值”將三個指標綜合為一個指標，在對提取溫度、提取時間

11、、液料比進行單因素考察基礎(chǔ)上，采用Box-Behnken響應(yīng)面法進行了工藝的優(yōu)化。通過Design-expert軟件7.0對此模型的最佳結(jié)果進行預(yù)測，當提取溫度為92.58℃，液料比為25.23:1，提取時間為2.42h時，預(yù)測最佳OD值為0.741，經(jīng)試驗驗證，獲得的OD值為0.7591，偏差僅為2.44％。最后進行了提取次數(shù)的考察，結(jié)果顯示第二次提取可明顯的改善提取效果，但再增加提取次數(shù)對成分的溶出率影響不大，因此選擇提取次數(shù)為2次

12、。考慮到實際操作的可行性，將最終提取工藝確定為提取溫度93℃，液料比25:1，提取時間92.4h，提取次數(shù)2次。通過建立以藥效組分為指標的提取工藝，可實現(xiàn)在同樣藥量下，保證有效成分的最大溶出，使得復(fù)方慢呼抗的作用得到進一步保障。
　　 本研究為中獸藥抗雞毒支原體藥效物質(zhì)基礎(chǔ)及質(zhì)量控制的研究提供了一條新途徑，即首先采用血清藥物化學的辦法確定中獸約體內(nèi)直接作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，冉用譜效結(jié)合的方法辨識出關(guān)鍵藥效組分。同時，提出以指紋圖譜結(jié)合