雞毒支原體兩種膜相關(guān)酶的生物學(xué)功能研究.pdf

1、雞毒支原體(Mycoplasmagallisepticum，MG)屬于柔膜體綱中的支原體目、支原體科、支原體屬，是重要的禽病原體之一，主要引起雞及其它禽類的慢性呼吸道疾病和火雞傳染性竇炎。雞毒支原體感染和寄生最重要的步驟是借助表面的膜蛋白牢固地黏附在呼吸道黏膜固有層。可以說，黏附能力決定著支原體致病性的強弱。有鑒于此，本文選取了兩種與致病力有關(guān)的膜相關(guān)酶——烯醇化酶(Enolase，Eno)和神經(jīng)氨酸酶(Neuraminidase，NA

2、)開展生物學(xué)功能研究，以揭示這些酶與MG致病機制之間的關(guān)系。
　　 1.MG烯醇化酶的生物學(xué)功能研究。
　　 根據(jù)Genbank中MGRlow株的全基因序列，設(shè)計重疊PCR引物，擴增獲得enolase基因，并成功獲得960nt和1158nt兩個位點的點突變。將突變后的enolase克隆入pET32a(+)載體中，進(jìn)行原核表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MGEno在大腸桿菌BL21(DE3)中呈高效可溶性表達(dá)。利用HisBandResin

3、對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化，純化產(chǎn)物命名為rMGEno，產(chǎn)量為4.2mg/250mL。利用純化的rMGEno免疫BALB/c小鼠，成功制備獲得特異性多抗(AE09)和6株單抗，分別命名為：1A4、1E5、2E4、2F8、3B4和3D8。根據(jù)Western-blot、ELISA方法分別對上述抗體的效價進(jìn)行了測定。
　　 為了驗證烯醇化酶是否在支原體表面存在，本研究利用膜蛋白Western-blot檢測、支原體懸浮熒光染色法和膠體金免疫電鏡

4、檢測，結(jié)果證明：MG的外膜上存在烯醇化酶。
　　 烯醇化酶也可作為胞內(nèi)酶參與糖酵解過程，催化2-磷酸甘油酸轉(zhuǎn)變?yōu)榱姿嵯┐际奖?。為了驗證原核表達(dá)產(chǎn)物的酶活性，本文通過NADH間接檢測法成功測定出rMGEno相對比活力為25.22IU/mg；并確定在加入1μgrMGEno時，D-2-PG→PEP的酵解反應(yīng)米氏常數(shù)Km為0.0696mol/L。
　　 為了研究烯醇化酶與MG黏附、入侵宿主細(xì)胞的關(guān)系，本文進(jìn)行了rMGEno與

5、血纖溶酶原(Plg)和纖連蛋白(Fln)的結(jié)合試驗以及MG細(xì)胞黏附、細(xì)胞入侵阻斷試驗。結(jié)果顯示：rMGEno為Plg與Fln結(jié)合蛋白，rMGEno抗體能夠有效抑制MG黏附和入侵細(xì)胞(P＜0.05)，黏附阻斷率與入侵阻斷率分別為80.06％、83.01％。
　　 綜上所述，我們可以證實：烯醇化酶是一種與固有層黏附有關(guān)的支原體膜相關(guān)酶，與雞毒支原體的細(xì)胞黏附和細(xì)胞入侵有直接關(guān)系；在體外活性試驗中，rMGEno具有烯醇化酶特性，具有良

6、好的免疫原性。
　　 2.MG神經(jīng)氨酸酶生物學(xué)功能的初步研究
　　 本研究通過神經(jīng)氨酸酶檢測試劑盒檢測本室保存的MG各強弱毒株及其對應(yīng)當(dāng)傳代株。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：MG強毒株的NA活性較強，弱毒株的NA活性則較弱；而且，隨著強毒株不斷傳代，毒力下降的同時，NA活性也明顯下降。由此初步證明，NA與MG的毒力和生物被膜的形成有著極為密切的關(guān)系。
　　 為了進(jìn)一步研究MG中NA的生物學(xué)功能，首先需要對NA基因進(jìn)行多點突變。本研究