豬嗜血支原體PCR和ELISA抗體檢測方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、豬嗜血支原體（Mycoplasma suis，M.suis）是一種寄生于紅細(xì)胞表面的病原微生物，臨床上急性感染豬可發(fā)生致死性溶血性貧血，慢性感染則表現(xiàn)為輕度貧血，消瘦，繁殖機能障礙等。豬嗜血支原體病在全球范圍內(nèi)廣泛分布，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了嚴(yán)重的經(jīng)濟損失，但診斷技術(shù)研究不多。本菌在體外尚不能培養(yǎng)。16S rRNA是M.suis的保守序列之一，也是病原分類的主要依據(jù)。MSG1蛋白是M.suis的一種重要的表面黏附蛋白，可能也是一種致病因子。本研

2、究具體內(nèi)容如下:
　　 1.豬嗜血支原體PCR及熒光定量PCR檢測方法的建立和比較
　　 根據(jù)已發(fā)表的豬嗜血支原體16S rRNA基因序列(FJ263944)設(shè)計合成PCR引物和熒光定量PCR引物及探針，以含16S rRNA基因的重組質(zhì)粒為陽性模板，通過對PCR反應(yīng)條件的優(yōu)化，建立了檢測豬嗜血支原體的PCR和熒光定量PCR檢測方法。PCR和熒光定量PCR分別能夠檢測出104個和10個拷貝的核酸分子，同PCR方法相比，熒光

3、定量PCR方法敏感性提高了1000倍;用兩種方法對豬霍亂沙門氏菌、腸致病性大腸桿菌、豬鏈球菌、多殺性巴氏桿菌、豬肺炎支原體、副豬嗜血桿菌、圓環(huán)病毒2型基因組DNA進行擴增，結(jié)果均為陰性;用這兩種PCR方法檢測20份臨床樣品，PCR方法的陽性率為60％(12/20)，而熒光定量PCR方法的陽性率為75％(15/20)，證明這兩種檢測方法都有很好的敏感性和特異性。
　　 2.豬嗜血支原體MSG1蛋白單克隆抗體的制備及鑒定
　　

4、 以原核表達(dá)純化的豬嗜血支原體MSG1蛋白免疫BALB/c小鼠，運用細(xì)胞融合技術(shù)篩選分泌針對MSG1蛋白抗體的融合細(xì)胞。通過間接ELISA方法篩選獲得兩株能穩(wěn)定分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞株，分別命名為1A7和3G6，Western blot結(jié)果證明這兩株單克隆抗體能夠與重組MSG1發(fā)生特異性反應(yīng)，間接免疫熒光試驗證明所制備的單抗能與天然抗原特異性結(jié)合。單抗1A7和3G6細(xì)胞上清和腹水中的ELISA抗體效價分別為1∶4096、1∶1024和1

5、∶1638400、1∶51200，體外培養(yǎng)連續(xù)傳代至第20代，分泌抗體的效價基本一致，其單抗亞類鑒定均屬于IgG1，輕鏈為κ型，抗原識別位點相同。
　　 3.豬嗜血支原體阻斷ELISA檢測方法的建立和初步應(yīng)用
　　 以純化的豬嗜血支原體重組MSG1蛋白和辣根過氧化酶標(biāo)記的MSG1蛋白單抗，建立阻斷ELISA方法用于檢測豬嗜血支原體抗體。經(jīng)篩選優(yōu)化的反應(yīng)條件為:抗原包被濃度為0.5μg/mL，封閉液為5％脫脂乳，封閉時間為

6、37℃3h，待檢血清稀釋度為1∶1，其作用時間為37℃1.5 h，酶標(biāo)單抗稀釋度為1∶5000，作用時間為37℃1h，37℃顯色15 min。通過對50份M.suis陰性血清阻斷ELISA檢測結(jié)果進行統(tǒng)計學(xué)分析，確定本方法的判定標(biāo)準(zhǔn)為:當(dāng)阻斷率(PI)≥37.25％時為陽性，PI≤25.44％時為陰性，25.44％＜PI＜37.25％時為可疑。應(yīng)用本方法對100份血清樣品進行檢測，以間接ELISA結(jié)果為標(biāo)準(zhǔn)，阻斷ELISA的敏感性和特異

7、性分別為92％和100％，表明本方法敏感性高特異性好。使用本研究建立的阻斷ELISA方法檢測豬圓環(huán)病毒2型、副豬嗜血桿菌、豬偽狂犬病病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒、豬腦心肌炎病毒參考陽性血清，結(jié)果均為陰性。批內(nèi)和批間重復(fù)性試驗結(jié)果變異系數(shù)均小于10％，表明本方法具有較好的特異性和重復(fù)性。應(yīng)用該阻斷ELISA方法檢測不同地區(qū)送檢的310份臨床血清，總陽性檢測率為52.26％,證明我國很多地區(qū)的豬場都存在M.suis感染的現(xiàn)象。