豬札幌樣病毒間接ELISA和熒光定量PCR檢測方法的建立.pdf

1、札幌樣病毒(Sapovirus, SaV)屬杯狀病毒科,為單股正鏈RNA病毒。豬感染SaV后表現(xiàn)出以腹瀉為主的胃腸炎癥狀。盡管豬SaV主要感染豬,但目前研究發(fā)現(xiàn)某些豬SaV毒株與人SaV毒株具有較高同源性,提示其可能具有在人與豬之間跨種間傳播的能力,這也對人類健康構(gòu)成了潛在的威脅。2008年中國大陸首次報(bào)道在規(guī)?；i場中發(fā)生SaV感染引起的仔豬腹瀉事件,說明豬SaV已給中國的養(yǎng)豬業(yè)造成了一定損失。因此,建立豬SaV的ELISA和熒光定量

2、PCR檢測方法具有重要意義。根據(jù)豬SaV外殼蛋白VP2基因設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增出目的片段VP2基因。將其克隆到原核表達(dá)載體pET-30a,經(jīng)酶切、測序鑒定后,再將重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21中,用終濃度l mmol·L-1 IPTG誘導(dǎo),表達(dá)產(chǎn)物以包涵體形式存在。超聲波裂解菌體后對包涵體進(jìn)行溶解,再用Ni-NTA柱對重組蛋白進(jìn)行純化,并對純化的蛋白進(jìn)行復(fù)性。經(jīng)Western-blot檢測表明,該重組蛋白能夠被SaV陽性血清所識別,具有良

3、好的抗原性。利用表達(dá)的重組融合蛋白作為抗原,建立了豬SaV的間接ELISA方法,并對其反應(yīng)條件進(jìn)行了摸索,確定了最適工作條件。結(jié)果表明,重組蛋白抗原的最適包被濃度為0.64μg·mL-1,最適包被條件為37℃1 h后4℃過夜,待檢血清的稀釋度為1:50,HRP-兔抗豬1gG的工作濃度為1:2000,待檢血清和酶標(biāo)二抗的反應(yīng)條件和反應(yīng)時(shí)間分別為37℃下1 h和40 min,TBM底物溶液室溫顯色10 min,陰陽性臨界值為0.203。重組

4、蛋白與豬戊型肝炎病毒、豬腸道病毒9型、豬諾如病毒、豬鏈球菌2型陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng),具有較好的特異性。利用已建立的ELISA方法檢測81份臨床血清樣品,檢出總陽性率為39.5％。結(jié)果表明,建立的間接ELISA方法敏感、特異,可用于臨床SaV血清樣品的檢測。這為ELISA診斷試劑盒的研制開發(fā)奠定了基礎(chǔ),為建立規(guī)?；i場SaV感染的快速診斷方法提供了科學(xué)依據(jù)。最后,根據(jù)豬SaV的保守基因序列設(shè)計(jì)引物和探針,通過對反應(yīng)條件的優(yōu)化,建立了Ta

5、qMan熒光定量PCR檢測方法,并與常規(guī)RT-PCR檢測方法進(jìn)行了比較。結(jié)果表明,熒光定量PCR方法的檢測下限可達(dá)16.1拷貝·μL-1,而常規(guī)RT-PCR方法的檢測下限為1.61×103拷貝·μL-1。對216份糞樣的檢測結(jié)果進(jìn)一步表明該法(檢出4份)比常規(guī)RT-PCR方法(檢出3份)的靈敏度高。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明,該4株病毒均為GIII型,與SaV上海分離株(FJ387164)同源性為100%。該方法具有靈敏度高、特異性強(qiáng)、操作簡便等