食源性腸球菌熒光定量PCR檢測方法的建立和評(píng)價(jià).pdf

1、腸球菌（Enterococcus spp.）是引起食源性疾病的一種重要的條件致病菌，容易污染乳制品、肉制品等。由于其經(jīng)加熱等加工流程后仍能存在，因聚餐引發(fā)的腸球菌食物中毒事件常有發(fā)生。此外，該菌對(duì)多種抗生素特別是萬古霉素具有高水平耐受性，其耐藥性可通過食品鏈轉(zhuǎn)移到人群，從而引發(fā)更大的食品安全隱患。因此，建立特異、靈敏和高效的檢測方法對(duì)于腸球菌的監(jiān)測與控制具有重要意義。
　　基于熒光定量PCR的檢測方法具有特異、靈敏、快速并可以實(shí)現(xiàn)

2、定量分析等優(yōu)勢，被廣泛應(yīng)用于食源性致病菌的檢測。目前文獻(xiàn)報(bào)道的腸球菌熒光定量PCR檢測靶點(diǎn)主要是16S rRNA和23S rRNA，數(shù)量有限且序列保守性過強(qiáng)。采用此類靶點(diǎn)建立的PCR體系，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。同時(shí)，PCR檢測體系對(duì)食品樣品檢驗(yàn)效果的有效性評(píng)估也較為缺乏。因此，發(fā)掘新的特異性更強(qiáng)的檢測靶點(diǎn)，并對(duì)PCR反應(yīng)體系應(yīng)用于食品樣品檢測時(shí)的效果作出評(píng)價(jià)是十分必要的。
　　本研究以基因組比對(duì)分析等生物信息學(xué)手段在腸球菌全基因組序

3、列中發(fā)掘特異性靶點(diǎn)，以得到的36個(gè)候選靶點(diǎn)序列設(shè)計(jì)50對(duì)引物，結(jié)合普通PCR和熒光定量 PCR驗(yàn)證，最終篩選出一個(gè)特異性強(qiáng)、靈敏度高的檢測靶點(diǎn)（EF1902），基于此靶點(diǎn)建立腸球菌熒光定量PCR檢測方法。采用該方法對(duì)44株腸球菌和23株非腸球菌菌株進(jìn)行檢測，以腸球菌基因組 DNA為模板均能采集到特異性擴(kuò)增信號(hào)，而以非腸球菌基因組DNA為模板時(shí)均無特異性擴(kuò)增信號(hào)形成。在最佳反應(yīng)參數(shù)（退火溫度60℃、染料濃度1μL，引物濃度0.2μmol/

4、L）下，熒光定量PCR方法的基因組DNA檢測靈敏度可達(dá)13.78 copies/PCR，純培養(yǎng)物靈敏度為38.4 cfu/PCR。對(duì)腸球菌人工污染牛奶樣品的檢測實(shí)驗(yàn)表明，當(dāng)初始接菌量為2.63 cfu/mL時(shí)，只需增菌6 h即可用該方法檢出腸球菌。通過對(duì)4大類（52份）食品樣品進(jìn)行PCR和傳統(tǒng)活菌計(jì)數(shù)法檢測的比較研究，發(fā)現(xiàn)本研究所建立的PCR方法準(zhǔn)確率達(dá)到94.23％。
　　本研究結(jié)合生物信息學(xué)方法和PCR方法發(fā)掘針對(duì)腸球菌的特異