細(xì)菌培養(yǎng)和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法檢測(cè)痰中肺炎鏈球菌.pdf

1、目的:慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)由于其患病率、死亡率較高已經(jīng)引起了社會(huì)的高度重視,尤其是慢性阻塞性肺疾病急性加重期(AECOPD),對(duì)疾病的臨床進(jìn)展意義較大。國(guó)內(nèi)外調(diào)查結(jié)果顯示細(xì)菌感染是引起慢性阻塞性肺疾病急性加重的主要原因,其中肺炎鏈球菌是重要致病菌之一。目前我國(guó)對(duì)下呼吸道感染致病菌檢測(cè)的主要方法為細(xì)菌培養(yǎng),但是由于部分細(xì)菌為苛養(yǎng)菌及抗生素濫用現(xiàn)象嚴(yán)重致使培

2、養(yǎng)結(jié)果陽性率較低;而經(jīng)口咳痰留取標(biāo)本行細(xì)菌培養(yǎng)也很難區(qū)分是感染還是污染所致的陽性結(jié)果;同時(shí)細(xì)菌培養(yǎng)所需時(shí)間較長(zhǎng),也不能及時(shí)指導(dǎo)臨床用藥而使培養(yǎng)方法廣受爭(zhēng)議。近些年來熒光實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)技術(shù)快速發(fā)展起來,大量的臨床研究證明real-time PCR技術(shù)對(duì)于下呼吸道感染臨床輔助診斷有很大幫助。本研究通過對(duì)59例AECOPD患者痰標(biāo)本細(xì)菌培養(yǎng)、30例患者痰標(biāo)本混肺炎鏈球菌后定量培養(yǎng)及51例患者痰標(biāo)本real-tim

3、e PCR方法檢測(cè)結(jié)果的比較,來探討細(xì)菌培養(yǎng)陽性率較低的原因及肺炎鏈球菌在慢性阻塞性肺疾病急性加重期中的作用。
　　 方法:
　　 1.用細(xì)菌培養(yǎng)方法檢測(cè)臨床收集的59例AECOPD患者痰標(biāo)本中的致病菌。
　　 2.患者痰標(biāo)本中混入肺炎鏈球菌定量培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組將7個(gè)濃度梯度的肺炎鏈球菌與隨機(jī)抽取的30例AECOPD患者痰標(biāo)本混勻,接種于血平板上定量培養(yǎng);對(duì)照組用同等濃度的純肺炎鏈球菌菌懸液,于血平板中定量培養(yǎng),比較

4、兩組培養(yǎng)結(jié)果。
　　 3.熒光實(shí)時(shí)定量PCR,即用肺炎鏈球菌質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品(濃度單位為copies)檢測(cè)自制的肺炎鏈球菌標(biāo)準(zhǔn)品(濃度單位為cfu)及臨床收集的51例AECOPD患者的痰標(biāo)本,比較三者之間的關(guān)系。
　　 結(jié)果:
　　 1.59例患者痰培養(yǎng)共分離出7種致病菌,其中包括熒光假單胞菌(7.14％)、銅綠假單胞菌(7.14%)、奇異變形桿菌為(7.14%)、肺炎克雷伯桿菌為(7.14%)、類白喉棒狀桿菌(7.1

5、4%),白色念珠菌(57.14%),未培養(yǎng)出肺炎鏈球菌。
　　 2.用生理鹽水稀釋的純肺炎鏈球菌菌懸液,當(dāng)103cfu/ml≤濃度＜10cfu/ml4時(shí),細(xì)菌培養(yǎng)27/30例為陽性,其余3/30為陰性,陽性率為90%;同等濃度的肺炎鏈球菌混入30例患者痰標(biāo)本后行細(xì)菌培養(yǎng),4/30例為陽性,其余26/30均為陰性,陽性率為13%,兩組實(shí)驗(yàn)結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。當(dāng)濃度≥104cfu/ml時(shí),兩組培養(yǎng)結(jié)果相同,陽性率均為1

6、00%,無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＞0.05)。
　　 3.Real-time PCR方法檢測(cè)59例標(biāo)本結(jié)果:當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品以copies為單位時(shí),≥104copies/ml有4/51例標(biāo)本(占7.8%),其中≥106有1/51例(占2.0%)、≥105有1/51例(占2.0%);當(dāng)標(biāo)準(zhǔn)品以cfu為單位時(shí),≥104cfu/ml共有18/51例標(biāo)本(占35.3%),其中≥106有1/51例(占2.0%)、≥105有4/51例(占7.8%)。

7、>　　 結(jié)論:
　　 1.59例患者痰液細(xì)菌培養(yǎng)沒有檢測(cè)出肺炎鏈球菌,與國(guó)內(nèi)外相關(guān)的文獻(xiàn)報(bào)道有較大差異。而通過痰液混入肺炎鏈球菌培養(yǎng)與純肺炎鏈球菌菌懸液培養(yǎng)結(jié)果比較,推斷痰中的某些因素可影響肺炎鏈球菌生長(zhǎng),但具體的影響因素還有待進(jìn)一步研究。
　　 2.用real-time PCR方法檢測(cè)肺炎鏈球菌其敏感性高于細(xì)菌培養(yǎng)方法;通過兩種濃度單位標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得結(jié)果的比較,認(rèn)為肺炎鏈球菌DNA提取過程中并不能100%回收;同時(shí)也進(jìn)一