兒童肺炎流行特征、病原體診斷方法評價和肺炎鏈球菌多重PCR分型方法研究.pdf

1、急性呼吸道感染是兒童最為常見的疾病。在廣大發(fā)展中國家,肺炎是5歲以下兒童死亡的首要原因。自上世紀70年代以來,兒童肺炎一直也是我國5歲以下兒童的首要死亡原因。然而,迄今為止,我國5歲以下兒童的肺炎死亡率和發(fā)病率等流行病學特征仍不清楚。對兒童肺炎病原體的正確診斷是預防和控制兒童呼吸道感染的關鍵所在。然而,由于難以獲取高質量的下呼吸道標本,肺炎病原體的診斷一直是醫(yī)學界的難題。深部吸痰法是近年發(fā)展起來的損傷性小的下呼吸道標本采集方法。為了正確

2、地使用和推廣該方法,本研究結合鼻咽拭子的檢測結果,對深部吸痰法的有效性和特異性等進行綜合性的評價。此外,為了了解我國肺炎鏈球菌菌株的血清分布和監(jiān)測其血清型的變更等,迫切需要尋找一種可替代莢膜腫脹試驗,且適用于發(fā)展中國家流行病學研究的肺炎鏈球菌分型方法,以控制肺炎鏈球菌感染,并為制定肺炎鏈球菌疫苗免疫策略提供依據(jù)。
　　第一部分系統(tǒng)性回顧中國兒童肺炎流行病學特征
　　系統(tǒng)的檢索了1950-2007年間公開發(fā)表的關于兒童肺炎發(fā)病

3、、死亡和病原體等相關的文獻。通過對NCBI,Cochrane,CNKI,VP,萬方等主要數(shù)據(jù)庫的檢索和手工檢索,共獲得6310篇文獻。經過篩選、全文閱讀、質量評價和文獻信息提取等,最終采納并進入分析的文獻共142篇。
　　20世紀90年代,來自黑龍江、內蒙古、寧夏、山東、北京、江蘇、云南、廣東等地以人群為基礎的兒童呼吸道感染監(jiān)測結果顯示,中國5歲以下兒童肺炎發(fā)病率為26.6％。兒童年齡越小,發(fā)病率越高。隨著年齡的增長,肺炎的發(fā)病率

4、迅速下降。不同地域兒童肺炎的發(fā)病率也有差異?？傮w來說,南方高于北方,尤其是西南、華南地區(qū)比華北、華東地區(qū)高。
　　肺炎一直是我國兒童,尤其是5歲以下兒童的首位死亡原因。1991-2000年間,全國兒童死亡調查結果顯示兒童總死亡率隨著時間有所下降,肺炎在所有死亡原因中占首位。年齡不同,兒童肺炎死亡率也不相同。低年齡組兒童肺炎死亡率高,隨著年齡的增長,肺炎死亡率迅速下降。在各地區(qū)之間,兒童肺炎死亡率差異較大,西部地區(qū)的兒童肺炎死亡率比

5、中東部地區(qū)高,而北方地區(qū)兒童肺炎死亡率高于南方地區(qū)。
　　病死率是反映疾病嚴重程度的一個重要指標。從年齡上看,新生兒的肺炎死亡率最高,達21.3％(95％CI:19.8％-22.9％)。5歲以下兒童的肺炎病死率明顯下降,僅為0.6％(95％CI:0.5％-0.7％)。北方地區(qū)兒童肺炎病死率為18.0‰(95％CI:13.7‰-22.2‰),高于南方地區(qū)的5.3％(95％CI:4.7‰-5.99‰)。西部地區(qū)兒童肺炎病死率高達11.

6、3960(95％CI:8.5‰-14.1‰),顯著高于中東部地區(qū)。
　　兒童肺炎的細菌檢出率為31.2％(95％CI:30.7％-31.8％),其中以新生兒肺炎的細菌檢出率較高。在陽性分離細菌中,新生兒以金黃色葡萄球菌為較為常見。較大年齡兒童中,肺炎鏈球菌,流感嗜血桿菌的陽性率也較高。不同年代、不同地區(qū)兒童肺炎的細菌學感染譜有所不同。
　　總而言之,我國屬于兒童肺炎高負擔國家,尤其是經濟相對落后地區(qū)5歲以下兒童的發(fā)病率和死亡

7、率居高不下。
　　第二部分對深部吸痰法診斷兒童肺炎病原體的評價
　　本研究旨在對深部吸痰法診斷下呼吸道感染兒童病原體的可行性、有效性和特異性等進行綜合評價。研究以2006年3月.2007年3月期間于蘇州兒童醫(yī)院住院治療的下呼吸道感染住院兒童(病例組)和無呼吸道感染的外科患兒(對照組)為研究對象,在征得其父母或監(jiān)護人的知情同意之后,對研究對象父母或監(jiān)護人進行面對面的問卷調查、病史摘錄及病案回顧等以收集相關的信息,同時采集研究對

8、象的鼻咽拭子和深部吸痰標本,送實驗室進行細菌學檢測,在標本的采集和實驗室操作過程中分別采取了嚴格質量控制和盲法。研究共入選了839名兒童,其中66人因標本采集不合格等原因而被剔除,最終773人(病例組379人,對照組394人)被納入數(shù)據(jù)分析。兩組研究對象在性別、年齡和入選時間等方面存在差異,并且86％的病例組兒童在入院前使用過抗生素。
　　根據(jù)研究假設,對照組兒童的深部吸痰結果的陽性率應為零或很低,病例組兒童的深部吸痰的陽性結果可

9、認為是下呼吸道感染的病原菌。然而,研究結果與研究假設相比有差異。即無呼吸道感染癥狀的對照組兒童的深部吸痰標本細菌陽性率高,如流感嗜血桿菌陽性率高達27.2％(95％CI:22.8％-31.5％),卡他莫拉菌的陽性率為22.1％(95％CI:18.0％-26.2％),肺炎鏈球菌的陽性率為8.4％(95％CI:5.6％-11.1％)。病例組兒童由于受到大量使用的抗生素的影響,深部吸痰標本的細菌陽性率相對較低,如流感嗜血桿菌陽性率為15.3％

10、(95％CI:11.7％-18.9％),卡他莫拉菌的陽性率為4.7％(95％CI:2.6％-6.9％),肺炎鏈球菌的陽性率為10.3％(95％CI:7.2％-13.3％)。兩組對象深部吸痰法的流感嗜血桿菌和卡他莫拉菌的陽性率差異有統(tǒng)計學意義。59名對照組兒童鼻咽部攜帶了肺炎鏈球菌,其中20名兒童的深部吸痰標本肺炎鏈球菌陽性,即深部吸痰法的假陽性率為33.9％(95％CI:20.7-47.0％)。鼻咽拭子和深部吸痰法檢測結果一致性較高,K

11、appa值位于0.37至0.64之間?？梢娚畈课捣ǖ臉吮臼艿缴虾粑勒＞旱母蓴_,假陽性率高,特異性較差。
　　當然,深部吸痰法也有其可取之處。雖然受到廣泛應用的抗生素的影響,但與鼻咽拭子相比,深部吸痰法的細菌分離率高。根據(jù)對采樣部位的分析,結合鼻咽拭子的檢測結果,深部吸痰法的檢測結果可以反映細菌向下侵襲的趨勢,對下呼吸道感染病原體的診斷有提示作用。結合臨床檢驗的結果,如結合革蘭氏染色和瑞氏染色,局部痰液標本中找到G+球菌和膿

12、細胞,有助于肺炎鏈球菌等常見呼吸道感染細菌的分離;血液中C反應蛋白水平和中性粒白細胞計數(shù)等,可以有助于下呼吸道感染病原體的診斷。
　　綜上所述,深部吸痰法檢測下呼吸道感染病原菌的特異性較差,容易受到上呼吸道攜帶細菌的干擾,不適合直接用于兒童肺炎病原體的診斷。
　　第三部分肺炎鏈球菌多重PCR分型方法的研究
　　本研究結合我國兒童肺炎鏈球菌常見的血清型和基因庫序列分析,設計血清型特異的PCR引物,以初步建立肺炎鏈球菌多重

13、PCR分型方法。通過與傳統(tǒng)的肺炎鏈球菌血清分型方法一莢膜腫脹試驗和經典的分子分型方法多位點序列分型方法(MLST)進行比較,研究和評價多重PCR的分子生物學分型方法用于判別肺炎鏈球菌血清分型的可行性、敏感性和特異性,旨在尋找一種適合于我國流行病學調查和研究的肺炎鏈球菌血清分型方法。
　　根據(jù)肺炎鏈球菌血清型相關基因cps的結構和組成,以及國內既往研究結果,設計我國較為常見血清型1,3,5,6,7F,9V,14,15A,15B/C,

14、18C,19F,19A,20,22F,23F等的特異引物,并優(yōu)化建立了多重PCR反應體系。從臨床分離的肺炎鏈球菌中成功區(qū)別血清型19F,19A,23F,14,18C,6A/B,15A,15B/C等常見血清型。對多重PCR的的初步分型結果,進行普通PCR反應驗證和PCR反應產物的測序等確認分型結果的準確性。
　　多重PCR分型結果與莢膜腫脹試驗分型結果相比,63株肺炎鏈球菌中,兩者分型結果一致的有52株菌,結果一致性達82.5％(9

15、5％CI:73.2％-91.9％),靈敏度為89.2％(95％CI:79.2％-99.2％),陽性預測值82.5％(95％CI:70.7％-94.3％)。在分型結果不一致的11株菌中,7株莢膜腫脹試驗尚未分出具體血清型別,多重PCR方法可區(qū)分其血清型,分別為血清型23F,19A,18C,6A/B等非常常見的血清型。此外,多重PCR方法還識別了兩種血清型19F和23F共存的現(xiàn)象。多重PCR分型結果與MLST分型結果相比,45株肺炎鏈球菌血

16、清分型結果一致的有40株,結果一致性達88.9％(95％CI:79.7％-98.1％),靈敏度為88.4％(95％CI:78.8％-98.0％),陽性預測值100％。
　　可見多重PCR分型方法與莢膜腫脹試驗和MLST分型結果一致性高,分型結果準確,可以同時篩查多種血清型,具有快速、便捷、客觀等優(yōu)點,其分型成本為各種分型方法中最低。此外,多重PCR方法可以對莢膜陰性肺炎鏈球菌菌株進行分型,也可識別多種血清型共存的現(xiàn)象,還可直接用于