兒童呼吸道感染病原學(xué)及肺炎鏈球菌耐藥的分子流行病學(xué)研究.pdf

1、[背景]
　　急性呼吸道感染(Acute Respiratory Infection,ARI)是嬰幼兒時(shí)期的常見病、多發(fā)病,同時(shí)也有著很高的病死率,給家庭和社會(huì)帶來了嚴(yán)重的負(fù)擔(dān)。因此了解ARI病原學(xué)的組成及危險(xiǎn)因素,可以用以指導(dǎo)臨床治療,從而有效地降低急性呼吸道感染的發(fā)病率和病死率。
　　肺炎鏈球菌作為急性呼吸道感染主要的條件致病菌,是引起全球所有年齡組高發(fā)病率和高死亡率的主要病原菌之一,尤其是3歲以下的嬰幼兒。但是日益增多

2、的多重耐藥性給臨床治療和疾病預(yù)防帶來了更大的挑戰(zhàn),因此了解肺炎鏈球菌感染的影響因素及其耐藥性顯得尤為重要。
　　耐大環(huán)內(nèi)酯類肺炎鏈球菌(Macrolide Resistant Streptococcus Pneumoniae,MRSP)已成為我國(guó)肺炎鏈球菌感染治療中最為嚴(yán)重的問題,對(duì)MRSP耐藥狀況和耐藥機(jī)制的準(zhǔn)確掌握是有效治療臨床肺炎鏈球菌感染、控制耐藥性播散的前提和基礎(chǔ)。由于不同地區(qū)耐藥狀況和耐藥機(jī)制有一定的差異,因此迫切需要

3、對(duì)MRSP進(jìn)行深入的分子流行病學(xué)的研究。
　　[目的]
　　了解住院患兒呼吸道感染的病原學(xué)及其影響因素,研究肺炎鏈球菌的耐藥情況以及耐藥性的傳播模式,為有效降低呼吸道感染,尤其是耐藥肺炎鏈球菌感染導(dǎo)致的發(fā)病和死亡提供科學(xué)依據(jù)。具體目的包括:
　　1.利用以醫(yī)院為基礎(chǔ)的監(jiān)測(cè)中收集的現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查資料和痰標(biāo)本,分析兒童呼吸道感染的病原學(xué)及其影響因素;
　　2.分析肺炎鏈球菌感染的危險(xiǎn)因素,對(duì)監(jiān)測(cè)期間收集的肺炎鏈球菌菌株進(jìn)行

4、耐藥分析,分析菌株的耐藥情況和多重耐藥模式;
　　3.研究耐大環(huán)內(nèi)酯類抗生素肺炎鏈球菌的耐藥表型和耐藥基因型,結(jié)合流行病學(xué)資料了解耐藥菌株的傳播方式,追蹤耐藥株的起源和進(jìn)化路徑。
　　[方法]
　　在蘇州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院進(jìn)行為期一年的3歲以下兒童呼吸道感染的監(jiān)測(cè),共收集2006年3月-2007年3月確診的3歲以下呼吸道感染病例453例,對(duì)每位研究對(duì)象進(jìn)行相關(guān)流行病學(xué)問卷調(diào)查(患兒的基本情況、既往病史、社會(huì)人口學(xué)資料、抗

5、生素使用史等)和采集痰標(biāo)本進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)和病毒鑒定。比值比(OddsRatio,OR)和95％可信區(qū)間(Confidence Interval,CI)的計(jì)算采用Logistic回歸模型,用以分析不同病原感染的影響因素。
　　利用Logistic回歸模型分析肺炎鏈球菌感染的危險(xiǎn)因素,同時(shí)對(duì)分離到的60株肺炎鏈球菌菌株進(jìn)行耐藥性分析,采用K-B紙片藥敏試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)苯唑青霉素、紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、氧氟沙星、氯霉素、萬(wàn)古霉素

6、、利福平等9種抗生素的敏感性,采用E-test藥敏試驗(yàn)檢測(cè)對(duì)5種抗生素(青霉素G、紅霉素、阿莫西林、頭孢呋辛、頭孢曲松)的敏感性,采用卡方檢驗(yàn)對(duì)肺炎鏈球菌感染的可能的影響因素進(jìn)行單因素分析。
　　采用雙紙片法檢測(cè)分離到的耐大環(huán)內(nèi)酯類肺炎鏈球菌(MRSP)菌株的耐藥表型,利用PCR對(duì)其進(jìn)行耐藥基因ermB和mefE的檢測(cè),分析耐藥表型與耐藥基因型的關(guān)系,同時(shí)采取多位點(diǎn)序列分型(Multilocus Sequence Typing,M

7、LST)技術(shù)分析其耐藥性的傳播方式,了解耐藥克隆的遺傳背景,追蹤耐藥株的起源和進(jìn)化路徑。
　　[結(jié)果]
　　3歲以下急性呼吸道感染的住院患兒以肺炎感染為主,占71.7％,其次是上呼吸道感染(Acute Upper Respiratory Infection,AURI),為14.3％。肺炎和AURI多發(fā)生于1歲及以下的兒童;春季入院的患兒最多,而秋冬季相對(duì)較少。89.6％的患兒入院前一周內(nèi)使用過抗生素,其中使用最多的兩類抗生素

8、依次為β-內(nèi)酰胺類和大環(huán)內(nèi)酯類,在應(yīng)用過抗生素的患兒中其使用率分別為88.2％和20.4％。
　　453例患兒中,細(xì)菌、病毒總陽(yáng)性率為48.6％,其中單純病毒感染32例(7.1％),單純細(xì)菌感染161例(35.5％),細(xì)菌病毒合并感染27例(6.0％)。細(xì)菌感染以流感嗜血桿菌(17.0％)、肺炎鏈球菌(13.2％)為主,病毒以呼吸道合胞病毒(Respiratory Syncytial Virus,RSV)和腺病毒(Adenovir

9、us,ADV)為主。不同疾病的病原譜也略有差異。AUR1患兒以流感嗜血桿菌(16.9％)、卡他布蘭漢菌(7.7％)、肺炎鏈球菌(6.2％)感染為主,合并感染較少,均為ADV合并細(xì)菌感染;肺炎患兒以流感嗜血桿菌(16.3％)、肺炎鏈球菌(14.5％)、RSV(7.2％)感染為主,合并感染以RSV和肺炎鏈球菌為主:其他下呼吸道感染患兒則以流感嗜血桿菌(20.6％)、肺炎鏈球菌(14.3％)、RSV(8.3％)感染為主,合并感染較少。此外本研

10、究還發(fā)現(xiàn)白色念珠菌和肺炎克氏菌等其他病原菌。
　　多因素分析顯示,不同年齡、季節(jié)的患兒病毒陽(yáng)性率不同,冬季入院的患兒病毒陽(yáng)性率最高(春季/冬季:OR=0.417,95％Cl:0.184-0.948;夏季/冬季:OR=0.135,95％CI:0.048-0.376;秋季/冬季:OR=0.126,95％CI:0.037-0.430)。1歲以上兒童的病毒陽(yáng)性率要高于1歲及以下的兒童(OR=2.094,95％CI:1.135-3.866)

11、。不同的病毒的陽(yáng)性率在季節(jié)和年齡分布上也有差異。RSV在冬季的陽(yáng)性率最高(26.4％):ADV在春季的陽(yáng)性率最高(6.1％),而且ADV的陽(yáng)性率隨著年齡的增加而增高。Inf-A在1-2歲的患兒中陽(yáng)性率最高(4.2％),在春秋季未發(fā)現(xiàn)Inf-A陽(yáng)性患兒。Inf-B和Pinf-1均只在春季入院的、1歲及以下的患兒中檢出。
　　研究顯示細(xì)菌總體陽(yáng)性率與季節(jié)有關(guān)。春季和夏季細(xì)菌陽(yáng)性率低于冬季,而秋季和冬季的陽(yáng)性率沒有區(qū)別(春季/冬季:OR

12、=0.419,95％CI:0.204-0.862:夏季/冬季:OR=0.336,95％CI:0.160-0.706;秋季/冬季:OR=0.780,95％CI:0.355-1.715)。不同細(xì)菌在不同季節(jié)的陽(yáng)性率也不同。流感桿菌多見于冬春季(P＜0.05):肺炎鏈球菌、副流感桿菌在冬季的陽(yáng)性率明顯高于其他季節(jié)(P＜0.05);金黃色葡萄球菌在秋季檢出略多(P＜0.05);銅綠假單胞菌則多見于夏季(P＜0.05),而卡他布蘭漢菌在各季節(jié)的陽(yáng)

13、性率未見明顯差異。
　　453例患兒中,共60人檢出肺炎鏈球菌,陽(yáng)性率為13.2％。多因素分析顯示患兒年齡和發(fā)病季節(jié)與肺炎鏈球菌的陽(yáng)性率有關(guān)。1歲及以下的患兒的肺炎鏈球菌的陽(yáng)性率要低于1歲以上的患兒(1歲及以下/1歲以上:OR=0.360,95％CI:0.184-0.704)。冬季肺炎鏈球菌的陽(yáng)性率最高,其次是春季和秋季,夏季最低(春季/冬季:OR=0.338,95％CI:0.144-0.792;秋季/冬季:OR=0.284,95

14、％CI:0.099-0.815:夏季/冬季:OR=0.218,95％CI:0.085-0.559)。其他因素如抗生素使用與否、既往呼吸系統(tǒng)病史、居室內(nèi)有無(wú)吸煙者、病毒檢出與否對(duì)患兒肺炎鏈球菌陽(yáng)性率均無(wú)影響(P＞0.05)。
　　肺炎鏈球菌的耐藥率非常高,對(duì)紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、復(fù)方新諾明、青霉素、頭孢呋辛、頭孢曲松、氯霉素、阿莫西林的耐藥率依次為100％、98.4％、96.7％、81.6％、60.4％、58.3％、13.3％、

15、12.5％和2.1％。未發(fā)現(xiàn)氧氟沙星、利福平和萬(wàn)古霉素耐藥菌株。48株菌株均對(duì)3種或3種以上的抗生素耐藥,多重耐藥率達(dá)100％。以青霉素+紅霉素+四環(huán)素+克林霉素+復(fù)方新諾明+頭孢呋辛多重耐藥模式為主,其次是紅霉素+四環(huán)素+克林霉素+復(fù)方新諾明。當(dāng)肺炎鏈球菌對(duì)青霉素的敏感性不同時(shí),對(duì)頭孢呋辛的敏感性也不相同(P=0.000),但對(duì)其他抗生素的敏感性未發(fā)現(xiàn)顯著性差異(P＞0.05)。青霉素敏感肺炎鏈球菌(PenicillinSuscept

16、ible Streptocococus Pneumniae,PSSP)多重耐藥性主要表現(xiàn)為紅霉素+四環(huán)素+克林霉素+復(fù)方新諾明耐藥,而青霉素耐藥肺炎鏈球菌(Penicillin ResistantStreptocococus Pneumniae,PRSP)則以紅霉素+四環(huán)素+克林霉素+復(fù)方新諾明+頭孢呋辛多重耐藥為主。
　　48株臨床分離的MRSP菌株的雙紙片法檢測(cè)結(jié)果顯示,43(89.6％)株為cMLSb型,4(8.3％)株為i

17、MLSb型,1(2.1％)株為M型。23株(47.9％)菌株僅檢測(cè)出ermB基因,24株(50.0％)菌株同時(shí)檢測(cè)出mefE基因和ermB基因,1株(2.1％)菌株僅檢測(cè)出mefE基因。1株僅檢測(cè)出mefE基因的菌株表現(xiàn)為M型,23株僅檢測(cè)出ermB基因的菌株均表現(xiàn)為MLSb耐藥,以cMLSb耐藥表型為主。24株同時(shí)檢測(cè)出mef和ermB基因的菌株均表現(xiàn)為cMLSb耐藥表型。
　　MLST法共檢測(cè)出16株新的序列型,其中1株(ST

18、4643)發(fā)現(xiàn)了新的位點(diǎn)基因gki237,而其他15株未發(fā)現(xiàn)新的位點(diǎn)基因,是已知7個(gè)位點(diǎn)基因的新組合所致(ST4628-4642),而且各個(gè)新序列型只有1株菌株。應(yīng)用eBURST V3軟件分析顯示,46株耐紅霉素肺炎鏈球菌共分為2個(gè)克隆復(fù)合體(CC271、CC876)和22個(gè)單一克隆菌株(singleton)。本研究共發(fā)現(xiàn)29株P(guān)MEN國(guó)際流行克隆株,依次為17株Taiwan19F-14、5株Netherlands15B-37、1株US

19、ANT-43、1株Spain9V-3、2株Netherlands3-31、1株Taiwaa23F-15、1株England14-9和1株Spain6B-2,占分離到的MRSP的63％。
　　PMEN克隆菌株與非PMEN克隆菌株對(duì)青霉素、頭孢呋辛的耐藥率有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P＜0.05)。PMEN克隆株以ermB和mefE基因共同介導(dǎo)為主,而非PMEN克隆株則以ermB基因介導(dǎo)為主。本研究未發(fā)現(xiàn)年齡、抗生素使用史等對(duì)PMEN菌株感染的影響