實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測巴爾通體方法的研究.pdf

1、目的:越來越多的巴爾通體物種感染人類疾病，嚴(yán)重的影響人類健康，給患者、家庭和國家造成重大的醫(yī)療衛(wèi)生經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。本課題應(yīng)用HRM技術(shù)建立快速檢測巴爾通體屬通用的方法。在確保檢測出所有巴爾通體物種的情況下，應(yīng)用雙重HRM方法和雙重實(shí)時(shí)熒光定量PCR探針法建立快速鑒定區(qū)分引起心內(nèi)膜炎常見的兩種病原體(Bq和Bh)，為臨床疾病的早期診斷、監(jiān)測和流行病學(xué)調(diào)查等研究提供有效的手段。
　　方法:查閱文獻(xiàn)查找巴爾通體屬的特異引物，應(yīng)用生物信息學(xué)方法

2、查找Bh和Bq特異基因，利用Primer Express3和Beacon Designer7設(shè)計(jì)引物和探針。隨后進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增，將產(chǎn)物連接到pEASY(R)-T5 Zero克隆載體上制備標(biāo)準(zhǔn)品。優(yōu)化擴(kuò)增反應(yīng)的退火溫度、引物探針的濃度和熔解速率;評估各方法的特異性、敏感性及重復(fù)性，分析擴(kuò)增效率和線性關(guān)系。
　　結(jié)果:優(yōu)化的退火溫度均為60℃，引物濃度均為300 nmoL/L，探針濃度均為200nmoL/L和熔解速率為0.2℃/s

3、。(1) HRM方法檢測巴爾通體屬方法結(jié)果顯示特異性很高，只有巴爾通體物種擴(kuò)增出熒光信號，熔解溫度為81.05℃±0.31，其他陰性對照菌株均未見熒光信號;敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在20μL的反應(yīng)體系中，Bh最低檢出限為3.82×101個(gè)拷貝，相關(guān)系數(shù)R2為0.999，擴(kuò)增效率E值為98.4％。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示組內(nèi)和組間的CV值分別為0.30％-0.62％和0.29％-0.36％。(2)雙重HRM方法檢測Bh和Bq結(jié)果顯示特異性很高;敏感性

4、實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在20μL的反應(yīng)體系中，Bh和Bq最低檢出限分別為3.64×101個(gè)拷貝和5.62×101個(gè)拷貝，此外也顯示出良好的線性關(guān)系和擴(kuò)增效率，其相關(guān)系數(shù)R2分別為0.998和0.997，E值分別為102.8％和104.7％。重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示組內(nèi)和組間的CV值為0.22％-0.50％和0.50％-1.20％。(3)雙重實(shí)時(shí)探針法檢測Bh和Bq結(jié)果顯示特異性良好;敏感性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在20μL的反應(yīng)體系中，Bh和Bq最低檢出限分別為3

5、.64×101個(gè)拷貝和3.28×101個(gè)拷貝，相關(guān)系數(shù)R2分別為0.994和0.998，擴(kuò)增效率E值分別為100.0％和103.4％;重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示組內(nèi)和組間的CV值分別為0.19％-0.53％和0.49％-1.66％。建立的方法敏感性均比常規(guī)PCR提高了100倍。
　　結(jié)論:本研究建立了HRM方法特異性強(qiáng)、靈敏度高、穩(wěn)定性好，可快速地檢測出所有的巴爾通體物種，為巴爾通體所引起的CSD、戰(zhàn)壕熱、心內(nèi)膜炎、BA和卡瑞恩病等一系列