實時熒光PCR檢測食品肉類種源方法研究.pdf

1、【目的】利用Taqman實時熒光PCR技術(shù)，建立豬、牛、羊、雞和鴨肉種源定性檢測體系，以鑒別相關(guān)食品肉源成分并鑒定食品標簽的真?zhèn)?；在準確定性基礎(chǔ)上，建立豬和雞源性食品相對定量體系，以甄別豬和雞肉類食品的輕微污染與故意摻假，并確定其摻雜摻假比例，為肉類食品安全監(jiān)督與執(zhí)法提供技術(shù)手段。
　　【方法】
　　1.食品中肉類種源定性檢測研究：以線粒體細胞色素b基因為擴增靶基因設(shè)計合成豬、牛、羊、雞和鴨肉五種肉源的特異性引物、探針，利用

2、非目標肉類DNA模板檢測引物和探針的特異性，以10倍濃度稀釋的特異種源肉DNA模板檢驗方法的靈敏度；自制模擬混合肉類樣品，檢測抗干擾能力及檢測限；并通過市售食品的檢測，驗證食品肉類種源定性檢測體系的應(yīng)用能力。
　　2.食品中肉類種源相對定量檢測研究：分別以豬、雞單拷貝基因為擴增靶基因設(shè)計合成豬、雞源的引物、探針，利用非目標肉類模板檢測引物、探針的特異性，自制含目標肉的模擬肉類混合樣品測定體系的檢測限和抗干擾能力；制備豬源、雞源和肉

3、類通用基因的重組質(zhì)粒以構(gòu)建外標準曲線，通過測定未知樣品中豬源和雞源Ct值和肉類通用基因Ct值求得各自拷貝數(shù)，以目的種源肉拷貝數(shù)與通用基因拷貝數(shù)的比值為參照判斷肉制品是否故意摻假以及摻假程度；利用自制模擬加工混合肉樣和市售食品檢測所建立體系的應(yīng)用能力。
　　【結(jié)果】
　　1．食品中肉類種源定性檢測研究：（1）所設(shè)計的五種引物探針，其擴增目的片度長度為88-110bp。各種源體系與非目標肉類無交叉擴增，特異性好，可達到的靈敏度范

4、圍為1-7pgDNA。（2）通過模擬混合肉樣檢測，證實該五種檢測體系抗干擾能力高，檢測限低，可低至1%（w/w）。（3）通過市售食品的檢測，證實對于不同加工處理的肉制品，所建立定性體系皆可準確檢測目的種源肉。
　　2.食品中肉類種源相對定量檢測研究：（1）所設(shè)計的豬源、雞源引物探針，其擴增目的片度長度為分別為91bp、110bp。各種源體系與非目標肉類無交叉擴增，特異性好；通過模擬混合肉樣檢測，抗干擾能力高，檢測限為1%（w/w）

5、。（2）利用重組質(zhì)粒構(gòu)建外標準曲線，肉類通用基因標準曲線方程為Y=-3.0066x+37.8346， R2=0.9987；豬源標準曲線方程為Y=-3.2611x+41.0013，R2=0.9993；雞源標準曲線方程為Y=-3.1247X+43.1488，R2=0.9996。（3）通過模擬加工混合肉樣的檢測，目標肉類摻加量分別為5%、30%和50%的混合樣品經(jīng)定量體系檢測所得摻假量分別為11.03%、32.55%和53.24%；市售食品的

6、定量結(jié)果也與實際結(jié)果相近，證實該定量體系可以用來甄別污染與故意摻假以及衡量摻假程度。
　　【結(jié)論】
　　1.肉類種源的定性檢測研究表明，所建立的體系特異性好，靈敏度高，市場應(yīng)用能力強，可滿足對于不同市售食品中目標肉類和非目標摻假肉類的定性檢測需要，可用于鑒別相關(guān)食品肉源成分并鑒定食品標簽的真?zhèn)巍?br>　　2.食品肉類種源的定量檢測研究顯示，針對單拷貝基因所設(shè)計的引物探針體系特異性高，能滿足定量檢測要求。通過構(gòu)建重組質(zhì)粒建立