實(shí)時(shí)熒光定量pcr技術(shù)

1、RealtimePCRfmRNAquantitation一、原理一、原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)是通過檢測PCR產(chǎn)物中熒光訊號強(qiáng)度來達(dá)到定量PCR產(chǎn)物的目的，目前該技術(shù)已在動植物基因工程，微生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域中得到廣泛應(yīng)用。實(shí)時(shí)定量PCR包括探針法和染料法兩種，探針法是利用與靶序列特異雜交的探針來指示擴(kuò)增產(chǎn)物的增加，特異性高，如TaqManTM技術(shù)；染料法則是利用染料來指示擴(kuò)增的增加，特異性相對較低，但簡便易行。染料法的原理是在PCR反應(yīng)體系

2、中，加入過量熒光染料，熒光染料特異性地?fù)饺隓NA雙鏈后，發(fā)射熒光信號，而不摻入鏈中的染料分子不會發(fā)射任何熒光信號，從而保證熒光信號的增加與PCR產(chǎn)物的增加完全同步。熒光染料發(fā)射出的熒光訊號強(qiáng)度與DNA產(chǎn)量成正比，檢測PCR過程中的熒光訊號便可得知靶序列初始濃度，從而達(dá)到定量目的。目前染料法實(shí)時(shí)熒光定量PCR主要使用的是美國MolecularProbes公司的SYBRGreen1和SYBRGold染料。二、實(shí)驗(yàn)步驟二、實(shí)驗(yàn)步驟一）、單鏈c

3、DNA摸板的合成（參照相關(guān)資料）二）、RealtimePCR操作方法(TIANGEN公司RealMasterMix(SYBRGreen)PCRKit)1、20SYBRGreensolution在室溫下平衡并徹底混勻。2、將125μL20SYBRGreensolution加入至1.0ml2.5ReaMasterMix中并輕輕混勻。3、照表1準(zhǔn)備多個PCR反應(yīng)混合物并分裝到各個PCR管中。4、將PCR管放入熱循環(huán)儀并啟動循環(huán)程序（表2）。三

4、、計(jì)算三、計(jì)算在定量PCR中，需要經(jīng)過數(shù)個循環(huán)后熒光信號才能夠被檢測到。熒光域值的缺省設(shè)置是315個循環(huán)的熒光信號的標(biāo)準(zhǔn)偏差的10倍。在實(shí)際操作中一般以前15個循環(huán)的熒光信號作為熒光本底信號。熒光定量PCR中一個關(guān)鍵的數(shù)據(jù)是“Ct（thresholdcycle）值”，其中“t”是Threshold，即PCR管內(nèi)熒光超過本底（達(dá)到可檢測水平）時(shí)的臨界目標(biāo)基因的相對表達(dá)量，就需要分別測定目標(biāo)基因和內(nèi)參基因的Ct值然后根據(jù)下列公式計(jì)算目標(biāo)基因

5、的相對表達(dá)量。內(nèi)參基因通常選用諸如Tubulin、Actin等組成性表達(dá)基因。目標(biāo)基因的相對表達(dá)量=2[(CtG處理CtT處理)(CtG對照CtT對照)]CtG處理：目標(biāo)基因在處理?xiàng)l件下的Ct值CtT處理：內(nèi)參基因在處理?xiàng)l件下的Ct值CtG對照：目標(biāo)基因在對照條件下的Ct值CtT對照：內(nèi)參基因在對照條件下的Ct值四、注意事項(xiàng)四、注意事項(xiàng)1、反轉(zhuǎn)錄（Rt）反轉(zhuǎn)錄用的RNA必須經(jīng)過DNA酶充分消化。因?yàn)殡p鏈DNA的存在會結(jié)合一定量的熒光染料