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文檔簡介
1、DNA甲基化作為表觀遺傳學的一種,在維持胚胎發(fā)育、基因印記、正常細胞功能以及人類疾病發(fā)生中起著重要作用。檢測DNA甲基化對疾病特別是腫瘤進行早期診斷、預后分析、合理用藥等有重要的臨床意義。因此快速準確、操作簡便、成本低廉的分析技術是甲基化研究及臨床檢測所必需的。 本文綜合比較了不同的DNA甲基化檢測技術的優(yōu)缺點后以及在臨床檢測的可行性,提出了改良多重實時熒光定量PCR技術(HANDs-qMSP),并利用該技術檢測64份大腸癌標本
2、及其正常對照的CpG島甲基化表型(CIMP),包括RUNX3、APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50,利用HANDs-qMSP技術對64份大腸癌組織及64份與之對應正常對照進行臨床評估,結果顯示,CIMP中至少有一個基因發(fā)生甲基化的概率為85.94%(55/64),其中RUNX3. APC、hMLH1、Vim-29及Vim-50的甲基化陽性率分別為7.81%(5/64)、15.63%(10/64)、29.69%(19/64)、6
3、5.63%(42/64)、54.69%(35/64),特異性分別為100.00%(64/64)、98.44%(63/64)、96.88%(62/64)、90.62%(58/64)、83.74%(54/64)。與普通多重實時熒光定量PCR方法和傳統的基于MethyLight發(fā)展起來的技術相比,HANDs-qMSP技術具有以下幾個優(yōu)點:(1) HANDs-qMSP技術設置了一份98%質控管,該質控管不僅可以作為100%陽性對照,還可作為亞硫
4、酸鹽轉化效率為98%的指標,用于指示標本亞硫酸鹽轉化效率的高低,從而有效避免由亞硫酸鹽轉化效率太低所導致的假陰性結果。(2)HANDs-qMSP技術采用了同源加尾(HAND)系統,HAND系統能有效地抑制引物二聚體的產生,減小多重PCR體系中各基因間擴增效率的差異,提高相對定量的精確度。本論文所建立的HANDs-qMSP體系最低可檢測到10pg/反應,且能精確定量至0.01%。同時HANDs-qMSP是多重PCR體系,在同一反應管中可同
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