壬基酚的熒光定量PCR檢測新方法研究.pdf

1、壬基酚(nonylphenol，NP)是環(huán)境內分泌干擾物質中具有代表性的物質，且化學性質比較穩(wěn)定，易富集于沉積物中，不易降解，暴露到環(huán)境中可導致生物與人體的性激素分泌量及活性下降，精子數(shù)量減少，生殖器官異常，癌癥等疾病的發(fā)病率增加，并使生殖能力降低，后代的健康與成活率下降，同時還可能影響到各種生物的免疫系統(tǒng)和神經系統(tǒng)，也可能導致生物基因突變等。目前壬基酚的檢測方法主要有氣相色譜法、氣相色譜-質譜法聯(lián)用和高效液相色譜法、液相色譜-質譜法，

2、后來又發(fā)展成固相萃取、吹掃捕集與氣相色譜法聯(lián)用，免疫分析方法和化學發(fā)光法偶有報道。用色譜法不僅昂貴費時，而且分析過程繁瑣冗長。近年來，隨著生物技術的發(fā)展產生了許多壬基酚的生物檢測方法。生物檢測中，PCR檢測技術由于其靈敏度高，檢測限更低，受到了廣泛關注。SYBR Green I熒光定量PCR是近年來出現(xiàn)的具有高靈敏度的定量PCR方法。目前，在壬基酚檢測領域，PCR技術主要應用檢測壬基酚的雌激素效應，直接用于檢測環(huán)境樣本中壬基酚的含量的研

3、究報導較少。本文采用體外DNA結合實驗，結合外切酶消解與熒光定量PCR技術，建立一種壬基酚的熒光定量PCR檢測新方法。
　　 壬基酚可以活化雌激素受體，使之與包含特定序列的雙鏈DNA結合，結合的DNA因受到蛋白質的保護可抵抗核酸外切酶ExonucleaseⅢ的消解而被保留下來，痕量的保留DNA可通過PCR擴增出來。根據(jù)此原理，本研究首先從魚肝臟中提取含雌激素受體的細胞溶質，與不同濃度的壬基酚結合使雌激素受體活化，形成受體-配體復

4、合物。再設計合成特異性引物序列，采用常規(guī)PCR方法擴增制備雙鏈結合DNA；使雙鏈結合DNA與受體-配體復合物反應結合后，用核酸外切酶和S1酶消解，去除未受到蛋白質保護的結合DNA。將消解后產物作為模板，進行熒光定量PCR擴增反應，從而建立Ct值與壬基酚濃度的標準曲線。同時探索最優(yōu)反應條件，并確定熒光定量PCR的最低檢測限及其結果的重復性。將該方法用于檢測實際環(huán)境樣品中壬基酚的含量，并將檢測結果同高效液相色譜法進行比較，比較兩種檢測方法的

5、不同。
　　 本課題主要試驗結果表明：
　　 (1)壬基酚暴露條件下，魚體內可產生較多的雌激素受體；實驗中采用羥基磷灰石微量法，將配體受體復合物純化，效果顯著，可減少PCR實驗中的非特異性擴增。采用SPR定性鑒定受體-配體復合效果，在加入壬基酚標準溶液濃度為10-8-10-2g/L范圍內，壬基酚配體濃度與受體-配體復合物的SPR響應強度之間呈線性關系。
　　 (2)以已知拷貝數(shù)的DNA做定量標準曲線，之后根據(jù)標準

6、曲線，及不同濃度壬基酚對應的模板拷貝數(shù)，得到壬基酚濃度與Ct的關系曲線，為：Ct=-1.828×log(壬基酚濃度)+11.447。分析可知，壬基酚濃度為10-8-10-2mol/L時，線性關系顯著(R2=0.99523)。確定本實驗建立的熒光定量PCR法對壬基酚的最低檢測限為10-8mol/L。
　　 (3)高效液相色譜法檢測壬基酚及與PCR方法的比較：論文建立了高效液相色譜法的標準直線，考察了方法的檢測限并應用于實際環(huán)境樣品