特異、敏感的肝細(xì)胞HBVcccDNA熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立.pdf

1、目的：探索和建立特異、敏感、可靠的熒光定量PCR方法檢測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)HBVcccDNA。 方法：取HBsAg陽(yáng)性37例的慢乙肝、30例慢乙肝合并肝癌患者的肝組織和7例血清標(biāo)記物及HBVDNA均陰性的非慢乙肝患者肝組織，用蛋白酶K裂解法釋放肝細(xì)胞核內(nèi)HBV DNA及基因組DNA后，采用濾柱法抽提DNA。用ATP依賴的DNA酶消化單鏈的DNA，設(shè)計(jì)檢測(cè)cccDNA和tDNA的特異性引物和探針進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增。同時(shí)以HBV全基因重組

2、質(zhì)粒pAM6做HBVcccDNA及tDNA檢測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性對(duì)照，并制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。擴(kuò)增樣本看家基因β-2M計(jì)算每次反應(yīng)的細(xì)胞數(shù)進(jìn)行絕對(duì)HBVcccDNA和tDNA的細(xì)胞定量(計(jì)算每個(gè)細(xì)胞含有的病毒拷貝數(shù))。將己知拷貝數(shù)的此重組質(zhì)粒pAM6參入HBV陰性的正常肝組織中，同時(shí)提取并檢測(cè)HBVcccDNA和tDNA的拷貝數(shù)以評(píng)價(jià)操作過(guò)程中可能的損失率，加以矯正，使得定量結(jié)果精確、可靠。 結(jié)果：本方法可以檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒、肝癌和慢乙肝肝組織標(biāo)本

3、的cccDNA、tDNA、β-2M范圍均為103-109拷貝/PCR。其中肝癌組cccDNA檢出率為73％，tDNA檢出率為100％；慢乙肝組cccDNA檢出率為75％，tDNA檢出率為89％。陰性對(duì)照組檢測(cè)cccDNA和tDNA均為陰性。所有肝組織標(biāo)本的β-2M檢出率為100％。 結(jié)論：本實(shí)驗(yàn)室研究建立的肝組織HBVcccDNA熒光定量檢測(cè)方法是特異性高、敏感性好、準(zhǔn)確的、可靠且實(shí)用性強(qiáng)?？捎糜诙繖z測(cè)肝細(xì)胞內(nèi)的cccDNA的