禽腺病毒熒光定量PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用.pdf

1、禽腺病毒(FAdV)是無(wú)囊膜、線性雙股DNA病毒，屬于腺病毒科、禽腺病毒屬成員。該病毒可感染雞、火雞及其他禽類。FAdV可致雞發(fā)生包涵體肝炎(IBH)、心包積水綜合征(HPS)和肌胃糜爛(GE)等疾病。禽腺病毒屬中包含8個(gè)種，分為禽腺病毒A～E、鵝腺病毒A、隼腺病毒A、及火雞腺病毒B。蛋雞和肉雞均可感染該病毒，通常3～5周齡較為易感。該病常與禽類其他病原混合感染，感染雞只可繼發(fā)再生障礙性貧血、肝炎及產(chǎn)蛋量下降等。FAdV呈世界性分布，病

2、毒可經(jīng)糞-口途徑水平傳播，也可垂直傳播，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。本研究建立FAdV熒光定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)方法，為FAdV的快速檢測(cè)提供技術(shù)手段，同時(shí)也為疫病凈化提供技術(shù)平臺(tái)，對(duì)促進(jìn)養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展具有重要意義。
　　對(duì)GenBank發(fā)表的FAdV-A、B、C、D和E種參考毒株的Hexon基因序列進(jìn)行多重比對(duì)，選擇保守區(qū)域設(shè)計(jì)兼并引物，使檢測(cè)引物具有FAdV各個(gè)種的種間通用性。應(yīng)用常規(guī)PCR方法從FAdV-

3、D基因組中擴(kuò)增Hexon-1基因片段，大小為191bp，將此片段克隆到pMD18-T載體，制備標(biāo)準(zhǔn)品，以標(biāo)準(zhǔn)品為模板進(jìn)行real-time PCR的擴(kuò)增，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。標(biāo)準(zhǔn)品在質(zhì)粒濃度為1×1010拷貝/μL～1×104拷貝/μL檢測(cè)范圍內(nèi)的錯(cuò)誤率為0.0599，擴(kuò)增效率為1.904，斜率為-3.575，具有良好的線性關(guān)系。對(duì)標(biāo)準(zhǔn)品1×1010拷貝/μL～1×104拷貝/μL濃度范圍進(jìn)行real-time PCR擴(kuò)增，其中標(biāo)準(zhǔn)品的敏感性

4、為1×103拷貝/μL。并對(duì)其分別進(jìn)行組內(nèi)重復(fù)和組間重復(fù)，組內(nèi)重復(fù)變異系數(shù)分別為0.22％、0.24％、0.11％、0.27％、0.18％、0.35％和0.37％;組間重復(fù)變異系數(shù)(CV％)分別為0.50％、0.86％、0.73％、1.32％、1.06％、0.56％和0.78％。因此本研究建立FAdV熒光定量PCR檢測(cè)方法具有良好的重復(fù)性及穩(wěn)定性。應(yīng)用建立的熒光定量PCR檢測(cè)方法，分別對(duì)禽腺病毒FAdV-D種及FAdV-C種的最小檢出滴

5、度進(jìn)行測(cè)定，對(duì)FAdV-D和FAdV-C種的檢測(cè)下限均為102TCID50/ml，是常規(guī)PCR檢測(cè)方法的10倍。說(shuō)明本研究建立的檢測(cè)FAdV熒光定量PCR的方法具有較好的敏感性。
　　將禽腺病毒FAdV-D毒株以相同劑量和滴度(100EID50)分別以卵黃囊（6.5日齡）、尿囊膜(9日齡)、尿囊腔（9日齡）途徑接種SPF雞胚，采集雞胚的組織包括腦、心臟、腸、肺臟、胸腺、肝臟、腺胃、腎臟、脾臟、法氏囊以及雞胚尿囊液和雞胚尿囊膜。結(jié)果

6、表明不同接種途徑對(duì)FAdV-D在SPF雞胚中的增殖影響較大，卵黃囊途徑接種SPF雞胚，雞胚尿囊膜及尿囊液中DNA拷貝數(shù)高于其他兩種接種途徑，其中經(jīng)卵黃囊、尿囊膜、尿囊腔途徑接種SPF雞胚，雞胚尿囊膜中DNA拷貝數(shù)分別為1.32×108拷貝/mg、2.89×105拷貝/mg及9.07×i04拷貝/mg，接胚尿囊液中DNA拷貝數(shù)分別為4.99×104拷貝/mg、3.28×104拷貝/mg及1.32×104拷貝/mg。因此，F(xiàn)AdV-D在SP

7、F雞胚中最適接種途徑為卵黃囊接種，病毒在雞胚尿囊膜和尿囊液中良好增殖，可收獲尿囊膜及尿囊液作為病毒儲(chǔ)液。病毒在雞胚肝組織中DNA拷貝數(shù)最高，為4.67×108拷貝/mg。此外，用Günes等已報(bào)道的real-time PCR檢測(cè)方法對(duì)上述結(jié)果進(jìn)行符合性檢驗(yàn)，與本研究建立的real-time PCR方法檢測(cè)結(jié)果相比，病毒在雞胚組織中的分布和組織中的病毒載量具有良好的一致性。
　　FAdV-D感染1日齡SPF雞，于攻毒后每4天采集口咽

8、和泄殖腔拭子，使用本研究建立的FAdV real-time PCR檢測(cè)方法檢測(cè)感染雞只排毒情況，持續(xù)檢測(cè)至攻毒后72d。結(jié)果表明，感染雞只于攻毒后4d開始排毒，攻毒后72d仍可從感染雞只口咽和泄殖腔拭子中檢測(cè)到病毒，經(jīng)口咽拭子檢出率為7/10(70％)，經(jīng)泄殖腔拭子檢出率為8/10(80％)。應(yīng)用常規(guī)PCR檢測(cè)方法對(duì)上述樣品進(jìn)行平行檢測(cè)，感染雞只于攻毒后4d開始排毒，至攻毒后72d，雞只口咽和泄殖腔拭子均檢測(cè)不到病毒。在攻毒后第8天，感

9、染FAdV-D組的雞群中有3只雞發(fā)病嚴(yán)重、瀕死，將3只瀕死雞安樂(lè)死處理，采集組織樣品，real-time PCR檢測(cè)病毒在感染雞體組織分布情況。結(jié)果表明，感染雞只各組織臟器中均有病毒存在，說(shuō)明FAdV為泛嗜性病毒，但主要嗜性組織為腸和肝臟，在直腸中檢測(cè)到病毒基因組拷貝數(shù)最高，在脾臟中病毒基因組拷貝數(shù)最低。
　　分別使用本研究建立的real-time PCR和常規(guī)PCR方法對(duì)收集到的我國(guó)10個(gè)省份143份疑似FAdV感染雞的組織病料