多肽酶檢測(cè)和細(xì)胞表面熒光標(biāo)記的新方法研究.pdf

1、生物傳感器作為現(xiàn)代傳感技術(shù)的一種，是一門物理、化學(xué)、生物、電子學(xué)、信息與計(jì)算機(jī)科學(xué)等多學(xué)科相互滲透相互促進(jìn)發(fā)展的綜合技術(shù)。生物傳感技術(shù)因其對(duì)分析化學(xué)發(fā)展的重大推動(dòng)作用，吸引了分析化學(xué)工作者的高度關(guān)注，它已成為最具發(fā)展?jié)摿蛯?shí)用價(jià)值的一種新型生物分析技術(shù)。與常規(guī)的化學(xué)或儀器分析方法相比，生物傳感器因其具有特異性好、體積小、靈敏度高、以及操作簡(jiǎn)便、快速、成本低廉且容易實(shí)現(xiàn)連續(xù)在線分析等優(yōu)點(diǎn)，在日常生活、生產(chǎn)和科研中有著重要應(yīng)用價(jià)值，在生化分

2、析、醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)、食品安全和環(huán)境監(jiān)測(cè)等諸多領(lǐng)域有重要應(yīng)用。
　　 本文以重要的多肽酶和目標(biāo)細(xì)胞為研究焦點(diǎn)，利用抗原與抗體之間特異性免疫結(jié)合和核酸適配體對(duì)細(xì)胞特異性識(shí)別，在常規(guī)分析檢測(cè)方法上，加上酶催化作用以及核酸鏈?zhǔn)诫s交反應(yīng)等信號(hào)放大技術(shù)，并引入多種不同的信號(hào)轉(zhuǎn)換方式，構(gòu)建了一些具有特異性好、靈敏度高、選擇性好、操作簡(jiǎn)便、信號(hào)響應(yīng)快且成本低等優(yōu)點(diǎn)的生物傳感器，具體研究如下:
　　 (1)基于熒光多肽探針和納米金構(gòu)建的熒光免疫

3、傳感器用于組蛋白去乙?；笝z測(cè)[第二章]
　　 本章建立了基于乙?；療晒舛嚯暮图{米金的熒光共振能量轉(zhuǎn)移的熒光免疫生物傳感器用于組蛋白去乙?；富钚缘臋z測(cè)。該方法將乙酰化的熒光底物探針和抗乙?；嚯目贵w修飾的納米金結(jié)合到一起來(lái)檢測(cè)組蛋白去乙酰化酶SIRT2的去乙?；钚?。酶對(duì)乙酰化多肽底物所發(fā)生的去乙?；饔檬峭ㄟ^(guò)金標(biāo)抗體所形成免疫復(fù)合物進(jìn)而導(dǎo)致的熒光染料和納米金之間的能量轉(zhuǎn)移而檢測(cè)到的。由于納米金的高效率熒光猝滅效應(yīng)，該方法具有

4、很低的熒光背景和較佳的靈敏度，在SIRT2濃度從50 nM到500 nM范圍內(nèi)，熒光峰強(qiáng)度與其對(duì)應(yīng)的SIRT2濃度成線性關(guān)系，根據(jù)3σ規(guī)則，該方法的檢測(cè)下限為11.9 nM。這種方法在組蛋白去乙?；敢种苿┗钚栽u(píng)價(jià)和抑制劑的篩選方面具有潛在的應(yīng)用前景。
　　 (2)基于酶信號(hào)放大的組蛋白去乙酰化酶檢測(cè)電化學(xué)免疫生物傳感器的構(gòu)建[第三章]
　　 本章基于乙?；嚯暮兔复呋饔眯盘?hào)放大構(gòu)建了電化學(xué)免疫生物傳感器用于組蛋白去乙

5、?；富钚缘臋z測(cè)及其抑制劑檢測(cè)。該方法將免疫反應(yīng)技術(shù)和酶催化作用放大信號(hào)結(jié)合到一起來(lái)檢測(cè)組蛋白去乙?；窼IRT2的去乙?；钚?。酶對(duì)乙酰化多肽底物所發(fā)生的去乙?；饔脵z測(cè)基本原理是:在不加入目標(biāo)分析物SIRT2條件下，通過(guò)乙?；嚯目贵w與電極表面修飾乙?；嚯慕Y(jié)合所形成免疫復(fù)合物，進(jìn)而被堿性磷酸酶標(biāo)記的二抗識(shí)別，并快速催化1-萘酚磷酸酯生成具有電化學(xué)活性的1-萘酚，將其作為電化學(xué)信號(hào)標(biāo)簽，引起放大的電化學(xué)信號(hào)響應(yīng)，而在目標(biāo)分析物SIR

6、T2存在下，該免疫傳感器呈現(xiàn)出電化學(xué)信號(hào)減小的現(xiàn)象，通過(guò)對(duì)比SIRT2加入前后，電化學(xué)信號(hào)變化來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)SIRT2的檢測(cè)。該傳感策略具有很好的分析性能，具有高靈敏度、簡(jiǎn)便和快速檢測(cè)等優(yōu)點(diǎn)。在SIRT2濃度從1 nM到500 nM范圍內(nèi)，熒光峰強(qiáng)度與其對(duì)應(yīng)的SIRT2濃度成線性關(guān)系，根據(jù)3σ規(guī)則，該方法的檢測(cè)下限為0.1 nM。
　　 (3)構(gòu)建標(biāo)記和非標(biāo)記的熒光DNA納米器件用于目標(biāo)細(xì)胞表面熒光標(biāo)記[第四章]
　　 細(xì)胞膜

7、參與了很多重要的細(xì)胞生命活動(dòng)，例如細(xì)胞粘附、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)，同時(shí)它也作為很多細(xì)胞外部結(jié)構(gòu)的附著位點(diǎn)。因而，細(xì)胞膜表面的修飾已成為生物活性分析和生命活動(dòng)調(diào)控等生物分析研究必不可少的一個(gè)方面，具有非常重要的應(yīng)用價(jià)值。在本章中了，我們報(bào)道了基于適配體連接的引發(fā)探針和核酸雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)信號(hào)放大，在目標(biāo)細(xì)胞表面構(gòu)建了標(biāo)記和非標(biāo)記的熒光DNA納米器件。該方法將核酸適配體的特異性識(shí)別作用和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)信號(hào)放大技術(shù)結(jié)合到一起用來(lái)對(duì)目標(biāo)細(xì)胞表面熒光標(biāo)記。該方案的

8、基本原理是:兩段部分互補(bǔ)的發(fā)夾單體DNA單鏈，在適配體．引發(fā)探針的觸發(fā)下，通過(guò)DNA雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，以自組裝方式形成多重的、交替的長(zhǎng)鏈DNA，命名為DNA納米火車(DNA Nanotrains)。我們分別采用化學(xué)標(biāo)記和物理嵌入的方式使該納米火車攜帶熒光染料分子，就構(gòu)建成標(biāo)記型和非標(biāo)記型熒光DNA納米器件。該器件的核酸適配體適配體部分能特異性識(shí)別并結(jié)合到目標(biāo)細(xì)胞表面，進(jìn)行熒光成像分析。這種納米器件因能裝載大量的熒光染料分子，具有熒光信號(hào)強(qiáng)的