基于近紅外熒光固相RCA檢測轉(zhuǎn)錄因子活性的新方法研究.pdf

1、轉(zhuǎn)錄因子(TF)是細(xì)胞內(nèi)一類調(diào)控蛋白，能特異結(jié)合基因組DNA的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)(TFBS)以調(diào)節(jié)基因的轉(zhuǎn)錄過程，在細(xì)胞多種生理和病理過程的基因表達(dá)調(diào)控中發(fā)揮了重要作用。例如，核因子-κB(NF-κB)是一種誘導(dǎo)型轉(zhuǎn)錄因子，廣泛存在于各種細(xì)胞中，NF-κB二聚體可以結(jié)合基因組中κB位點(diǎn)，來調(diào)控許多細(xì)胞過程（例如免疫和炎癥）中靶基因的表達(dá)。對于研究這類轉(zhuǎn)錄因子的功能，分析它們的DNA結(jié)合活性是必不可少的。所以，轉(zhuǎn)錄因子活性檢測技術(shù)已經(jīng)被高度

2、重視，但目前的檢測技術(shù)存在通量低、依賴抗體等缺點(diǎn)，因此，在轉(zhuǎn)錄因子活性研究中，發(fā)展一種高靈敏性、高通量、不依賴于抗體的新檢測方法仍有必要。
　　滾環(huán)擴(kuò)增(RCA)是一種高靈敏性等溫DNA擴(kuò)增技術(shù)，它具有恒溫低溫?cái)U(kuò)增和高靈敏性的優(yōu)勢，RCA已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于目標(biāo)核酸分子的擴(kuò)增檢測。近紅外熒光(NIRF)因其高信噪比和較強(qiáng)的組織穿透性而被迅速應(yīng)用于生物分子的體外測定。本論文結(jié)合RCA和NIRF的技術(shù)優(yōu)勢，發(fā)展了一種基于近紅外熒光固相RC

3、A(NIRF-sRCA)的轉(zhuǎn)錄因子活性檢測新方法。該方法檢測轉(zhuǎn)錄因子前，首先設(shè)計(jì)并制備轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合探針(TFBP)，捕獲探針(CP)和滾環(huán)模板;其中TFBP上有含有靶轉(zhuǎn)錄因子的TFBS、捕獲探針退火區(qū)及滾環(huán)退火區(qū);CP經(jīng)氨基修飾共價固定在醛基修飾的玻片表面，制成CP陣列;滾環(huán)模板可與TFBP上的滾環(huán)退火區(qū)雜交。該方法的基本檢測流程為:(1)將TFBP與待檢蛋白樣品共孵育;(2)用自然聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白結(jié)合TFBP與游離TFBP;

4、(3)將蛋白結(jié)合TFBP和滾環(huán)與CP陣列雜交;(4)固相RCA擴(kuò)增滾環(huán)，并通過摻入biotin-dUTP標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物;(5)近紅外熒光標(biāo)記的鏈親和素（streptavidin-800CW）與固相RCA擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合;(6)近紅外熒光成像儀掃描玻片。
　　本論文以NF-κB為檢測對象，論證NIRF-sRCA的可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，本論文建立的近紅外熒光固相RCA系統(tǒng)能非常靈敏地檢測樣品中的目標(biāo)核酸分子，最低可檢測10 fmol目標(biāo)核酸

5、分子。通過檢測NF-κB p50純蛋白及HeLa細(xì)胞核提取物，證明了該方法的可行性和可靠性。NIRF-sRCA可以對NF-κB p50純蛋白進(jìn)行定量檢測，最低可檢測6.94 ng p50純蛋白。NIRF-sRCA檢測細(xì)胞核提取物中NF-κB時，加入競爭性探針檢測實(shí)驗(yàn)和質(zhì)量梯度實(shí)驗(yàn)表明該方法可特異地定量檢測細(xì)胞核提取物中NF-κB，最低可檢測0.625μg核蛋白。同時，設(shè)計(jì)了其他5種轉(zhuǎn)錄因子蛋白(TFIID、p53、CREB、NF-E2、

6、AP-1)的探針，使用NIRF-sRCA檢測了HeLa細(xì)胞核提取物中6種轉(zhuǎn)錄因子的活性，結(jié)果表明NIRF-sRCA可特異性地同步檢測HeLa細(xì)胞核提取物中6種轉(zhuǎn)錄因子的DNA結(jié)合活性，并確定TNF-α誘導(dǎo)使NF-κB上調(diào)2.54倍，TFIID上調(diào)1.43倍，p53上調(diào)1.36倍，CREB上調(diào)1.8倍，NF-E2上調(diào)1.18倍，AP-1上調(diào)1.28倍，該檢測結(jié)果與TranSignal Protein/DNA array I檢測結(jié)果一致。<