切口酶介導增益性RCA信號放大microRNA檢測adddd dfdd新方法研究.pdf

1、生命個體由多種有機物及無機物組成，生物體的種種生命活動是化合物相互間高度有序作用的結果。人們對生命現(xiàn)象的研究不再只停留在個體、系統(tǒng)、器官、組織及細胞水平上，更要探討組成生物體的物質的結構與功能。因此，對生物大分子的檢測，是生命科學研究及醫(yī)學診斷的實際需要。傳統(tǒng)的檢測技術，如聚合酶鏈反應、western印跡、質譜，存在儀器昂貴、耗時、操作復雜的問題。隨著檢測技術在醫(yī)療領域的廣泛應用，對快速、簡便的檢測方法的需求不斷擴大。等溫檢測對儀器要求

2、低，操作簡便，可以在有限的條件下進行檢測。
　　非編碼小RNA在體內起多重調控作用，是生物體內一類重要的物質。有數(shù)種類型的小型非編碼RNA在真核細胞中發(fā)揮功能，其中包括18-24個核苷酸的microRNA，21個核苷酸的siRNAs，26-30個核苷酸的piRNA。microRNA是基因表達的內生調控元件，主要功能是在轉錄后抑制mRNA翻譯。高靈敏度、高特異性的小RNA檢測不僅是研究受這些RNA調控的生理過程的需要也是更好地理解相

3、關疾病的需要。
　　惡性腫瘤已經(jīng)成為人類死亡的第一位原因，每年約有上千萬人死于各種癌癥。癌癥由多因素引起的疾病。隨著現(xiàn)代工業(yè)的發(fā)展和生活方式的變化，腫瘤的發(fā)病率與死亡率呈明顯上升趨勢。早期的腫瘤較容易切除，可以延長患者存活時間。因此，腫瘤的早期診斷和預防是現(xiàn)今腫瘤臨床研究的熱點。
　　近年來研究發(fā)現(xiàn)，microRNA與多種人類腫瘤相關。并有實驗證實microRNA既有抑癌作用,又有促癌作用。microRNA是基因表達調控網(wǎng)絡

4、的重要組成部分，影響著多條信號傳導通路。對不同腫瘤組織特定microRNA表達水平的檢測和研究不但利于闡明腫瘤的發(fā)生發(fā)展機制，而且可以為腫瘤的診斷和治療提供理論依據(jù)。
　　以核酸互補雜交原理為基礎，人們根據(jù)microRNA的特點發(fā)展了許多的檢測方法。其中，等溫技術在現(xiàn)場快速檢測診斷方面優(yōu)勢明顯。而且核酸等溫擴增技術由于不需要溫度變化的時間過程，使其擺脫了對變溫儀器的依賴，實現(xiàn)快速檢測。
　　由于以上原因，綜合文獻報道，本研究

5、選擇microRNA let-7a作為檢測對象，聯(lián)用了分子信標、鎖式探針、連接酶、聚合酶 phi29、限制性單鏈切割酶Nt.BbvCI，建立了一種簡便、快速的生物大分子熒光信號放大檢測技術，即切口酶介導增益性RCA信號放大microRNA檢測。我們設計了一種帶兩個切口酶Nt.BbvCI的鎖式探針與分子信標，當鎖式探針與let-7a結合后，在連接酶的作用下形成環(huán)，然后聚合酶以microRNA為引物，以環(huán)為模板進行滾環(huán)反應。鎖式探針及分子信