核酸分子的尼龍膜固相滾環(huán)擴(kuò)增近紅外熒光檢測(cè).pdf

1、尼龍膜是一種核酸檢測(cè)的傳統(tǒng)固相載體，其本身攜帶正電荷，可直接通過靜電吸附和簡單的UV交聯(lián)固定核酸分子，操作簡單快捷。滾環(huán)擴(kuò)增(rolling circle amplification，RCA)是一種等溫DNA擴(kuò)增技術(shù)，廣泛應(yīng)用于核酸的檢測(cè)。近紅外熒光（near infrared fluorescence，NIRF）因其背景低而具有高靈敏度的特點(diǎn)。本研究利用尼龍膜、RCA及NIRF的技術(shù)優(yōu)勢(shì)，建立了一種尼龍膜上近紅外熒光固相RCA(M-N

2、IRF-sRCA)檢測(cè)核酸分子的新方法。
　　M-NIRF-sRCA檢測(cè)系統(tǒng)僅包含兩種寡核苷酸:特異性的探針（3'端為滾環(huán)引物）和滾環(huán)(rollingcircle，RC)。檢測(cè)流程分四個(gè)步驟:(1)固定:通過UV交聯(lián)將待測(cè)靶分子固定在尼龍膜上;(2)雜交:將含有特異性滾環(huán)引物和RC的雜交體系加至尼龍膜上進(jìn)行雜交;(3)滾環(huán)擴(kuò)增:將固相RCA體系（包括ψ29 DNA聚合酶、RC、dNTP、biotin-dUTP）加至尼龍膜上進(jìn)行RC

3、A反應(yīng);(4)成像:使用近紅外熒光素標(biāo)記的鏈霉親合素（streptavidin-800CW）與尼龍膜上擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行孵育結(jié)合后，使用Odyssey近紅外熒光成像系統(tǒng)對(duì)尼龍膜進(jìn)行掃描成像，讀取熒光信號(hào)。
　　本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)寡核苷酸分子、質(zhì)粒和細(xì)菌基因組DNA的檢測(cè)，證明了M-NIRF-sRCA的可行性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:M-NIRF-sRCA可定量檢測(cè)寡核苷酸分子，靈敏度為0.17 fmol，檢測(cè)線性范圍是0.17fmol～0.35 pmo

4、l; M-NIRF-sRCA也可定量檢測(cè)HPV質(zhì)粒，最低可檢測(cè)到0.25 fmol的高危型HPV16、HPV18和HPV33分子，檢測(cè)線性范圍為0.25 fmol～4fmol,并能實(shí)現(xiàn)6種HPV亞型的分型，包括高危型的HPV16、HPV18、HPV33、HPV35和低危型的HPV6和HPV11;另外，經(jīng)過改善后，M-NIRF-sRCA又可定量檢測(cè)DH5α gDNA，檢測(cè)靈敏度達(dá)3.09 ng gDNA分子，相當(dāng)于3000個(gè)細(xì)菌，可檢測(cè)D