鑒別牛羊布魯菌實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法的建立.pdf

1、本試驗(yàn)旨在建立準(zhǔn)確、快速的檢測(cè)布魯菌、羊種布魯菌、牛種布魯菌的方法。以BCSP31作為布魯菌菌屬特異性基因，以IS711插入元件作為布魯菌菌種特異性標(biāo)志，設(shè)計(jì)布魯菌、羊種布魯菌、牛種布魯菌的特異性引物和Taqman探針，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒模板，優(yōu)化了多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系和條件，并將標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒10倍倍比稀釋作多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR標(biāo)準(zhǔn)曲線，評(píng)價(jià)多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系的敏感性、特異性、重復(fù)性，建立了鑒別牛羊種布魯菌的實(shí)時(shí)熒

2、光定量PCR方法，并用此方法對(duì)臨床樣品進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果顯示：引物濃度400nM，探針濃度200nM，退火溫度60℃為所建立多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR的最佳反應(yīng)體系和條件。此診斷方法可以特異地檢測(cè)布魯菌、牛布魯菌、羊布魯菌，不與其它革蘭氏陰性細(xì)菌發(fā)生交叉反應(yīng)，特別是與布魯菌有強(qiáng)烈交叉反應(yīng)的小腸結(jié)腸炎耶爾森菌O:9，表明其具有良好的特異性。另外，此診斷方法Cq值的變異系數(shù)均小于0.05，檢測(cè)限為2.8fg～3.2fg，表明其具有良好的可靠性、穩(wěn)定