豬嗜血支原體的豬體感染試驗(yàn)和小鼠感染試驗(yàn)研究.pdf

1、豬嗜血支原體病即豬附紅細(xì)胞體病（PorcineEperythrozoonosis，PE）是由豬嗜血支原體（Mycoplasma.suis,M.suis）寄生于紅細(xì)胞導(dǎo)致的一種熱性、急性、溶血性黃疸貧血人獸共患傳染病。慢性輕度感染的臨床表現(xiàn)多樣，從無癥狀感染到一系列臨床癥狀感染，新生仔豬表現(xiàn)為貧血、溫和性黃疸，育肥豬生長遲緩，青年母豬繁殖能力下降。由于急性貧血和慢性持續(xù)性感染能夠提高呼吸和消化系統(tǒng)疾病的易感性，該病對養(yǎng)豬業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)

2、損失。為了深入研究豬嗜血支原體致病機(jī)制，本研究建立了豬嗜血支原體實(shí)時熒光定量PCR，闡明了豬嗜血支原體血液中含量和血液動力學(xué)之間的相關(guān)性。而且，通過感染豬體實(shí)驗(yàn)記錄了豬嗜血支原體病的臨床癥狀、血液學(xué)和生物化學(xué)指標(biāo)、菌血癥、抗體水平、細(xì)胞因子變化以及組織病理學(xué)等各個方面變化，同時建立了小鼠6種細(xì)胞因子的實(shí)時熒光定量PCR方法和進(jìn)行了小鼠的初步感染試驗(yàn)。具體研究內(nèi)容和結(jié)果分為以下3個部分:
　　1.豬嗜血支原體熒光定量PCR檢測方法的

3、建立
　　根據(jù)GenBank發(fā)表的豬嗜血支原體16SrRNA基因序列設(shè)計合成熒光定量PCR引物，用構(gòu)建的含16SrRNA基因的重組質(zhì)粒為陽性模板，通過優(yōu)化反應(yīng)條件，建立豬嗜血支原體熒光定量PCR檢測方法。用建立的SYBRGreen-basedreal-timePCR方法對豬嗜血支原體進(jìn)行定量。根據(jù)熔解曲線、瓊脂糖凝膠電泳以及擴(kuò)增片段測序分析確證方法的特異性;用構(gòu)建的豬嗜血支原體16SrRNA基因的陽性質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，

4、并分析其敏感性;通過組內(nèi)和組間試驗(yàn)檢測建立的檢測方法的重復(fù)性。結(jié)果證明此方法有很好的特異性、敏感性和重復(fù)性，檢測的下限是15個拷貝的豬嗜血支原體。本方法能夠很好的用于對豬嗜血支原體準(zhǔn)確定量。
　　2.豬嗜血支原體病感染模型的建立
　　豬嗜血支原體病是一種熱性、急性、溶血性黃疸貧血人獸共患傳染病。為研究豬嗜血支原體致病機(jī)制，本研究將10頭保育豬（5-6周齡）隨機(jī)分為3組，分別為攻毒豬嗜血支原體組（3頭，A組）、切脾后攻毒豬嗜血

5、支原體組（4頭，B組）和對照組（3頭，C組）。感染后隔離飼養(yǎng)，每天測量體溫以及觀察臨床癥狀，每周測量兩次體重。在7、14、21、28天時分別采集各組血液樣本檢測血液學(xué)和生物化學(xué)指標(biāo)、菌血癥、抗體水平以及細(xì)胞因子，28天時，對三組豬進(jìn)行病理剖檢和組織學(xué)檢查。感染后一周內(nèi)A組和B組都出現(xiàn)臨床癥狀，C組沒有明顯臨床癥狀。在感染后7天時，A組和B組均檢測到水平相當(dāng)?shù)木w，達(dá)到1.0×105拷貝/mL血液。14天時，B組達(dá)到1.0×108拷貝/m

6、L血液，并在這一水平小幅波動直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束;而和感染后一周相比，A組菌血癥在14天時略有上升，到21天時急劇上升到和B組達(dá)到同一水平并直至實(shí)驗(yàn)結(jié)束。血液學(xué)和生物化學(xué)檢測指標(biāo)顯示，7天時，B組的紅細(xì)胞計數(shù)顯著高于C組，而到21天時，B的紅細(xì)胞計數(shù)、血細(xì)胞比容、血鐵含量、血紅蛋白濃度均低于C組;B組的紅細(xì)胞計數(shù)和血紅蛋白含量顯著低于C組。豬嗜血支原體量和白細(xì)胞計數(shù)、血細(xì)胞比容、紅細(xì)胞計數(shù)和鐵等指標(biāo)顯著相關(guān)。21天時，A組中只有1頭豬產(chǎn)生豬嗜血

7、支原體抗體，28天時此豬抗體阻斷率上升;其余的豬體內(nèi)并未檢測到豬嗜血支原體抗體。三組豬血清中均沒有檢測到細(xì)胞因子IL-4和IFN-γ。本研究復(fù)制出了豬嗜血支原體病，探討了該病的發(fā)生發(fā)展過程，為該病的致病機(jī)制、預(yù)防、診斷等方面的研究奠定基礎(chǔ)。
　　3.小鼠細(xì)胞因子熒光定量PCR檢測方法的建立
　　本研究從小鼠脾臟分離淋巴細(xì)胞中提取細(xì)胞因子mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用實(shí)時熒光定量PCR方法監(jiān)測IL-2、IL-4、IL-6、I

8、L-10、IFN-γ和IFN-β的mRNA表達(dá)水平。根據(jù)熔解曲線、瓊脂糖凝膠電泳以及擴(kuò)增片段測序分析各細(xì)胞因子的特異性;分別對構(gòu)建的含各細(xì)胞因子基因部分序列的陽性質(zhì)粒進(jìn)行梯度稀釋建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并分析其敏感性;通過組內(nèi)和組間試驗(yàn)檢測建立的檢測方法的重復(fù)性。建立的各個細(xì)胞因子實(shí)時熒光定量PCR檢測方法具有良好的特異性、敏感性和重復(fù)性。IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IFN-γ和IFN-β檢測的敏感性分別可達(dá)到50拷貝、50拷貝、2