豬Coronin 1A基因在副豬嗜血桿菌感染過程中的功能研究.pdf

1、副豬嗜血桿菌是引起格拉澤氏病的病原體，該病嚴重地威脅著全世界范圍內(nèi)的豬群，給養(yǎng)豬業(yè)帶來了巨大的經(jīng)濟損失，臨診上多表現(xiàn)為多發(fā)性漿膜炎、關節(jié)炎和腦膜炎。眾所周知，副豬嗜血桿菌只有抵抗了宿主肺臟的吞噬作用才能產(chǎn)生系統(tǒng)性疾病，而肺臟的第一個防御機制是豬肺泡巨噬細胞，它在清除風媒傳播的病原體和其他環(huán)境微生物中發(fā)揮了重要作用。有趣的是，高毒力副豬嗜血桿菌能夠阻止豬肺泡巨噬細胞的吞噬作用，然而低毒力菌株則被豬肺泡巨噬細胞吞噬并清除。最近有文獻報道稱副

2、豬嗜血桿菌感染PK-15細胞能夠激活NF-κB信號通路，其機制是促進IκB的降解和p65的磷酸化，繼而刺激多種炎性因子的產(chǎn)生介導炎性應答。然而，副豬嗜血桿菌感染的致病機制還不甚清楚。
　　 Coronin1A蛋白是哺乳動物coronin蛋白質(zhì)家族的一員，也稱為TACO或p57蛋白，主要表達于造血組織及細胞中，主要分布于細胞胞漿中。Coronin1A被認為在T淋巴細胞活化、遷移、存活和鈣離子信號轉(zhuǎn)導中發(fā)揮了重要作用。先前的文獻報道

3、稱人源Coronin1A與致病性結(jié)核分枝桿菌在機體內(nèi)存活有關，其中Coronin1A在結(jié)核分枝桿菌感染過程中主要參與調(diào)節(jié)吞噬小體與溶酶體的融合形成吞噬溶酶體的過程。另外，在麻風分枝桿菌感染過程中，人源Coronin1A也被認為是能夠抑制Tol1-2受體介導的NF-κB信號通路。因此，Coronin1A蛋白在細菌感染過程中能夠通過調(diào)節(jié)機體免疫應答和吞噬過程而有助于細菌逃避宿主的清除作用。
　　 在實驗室前期研究中，我們首先從感染副

4、豬嗜血桿菌的肺泡巨噬細胞中克隆到了Coronin1A基因，在基因芯片中其轉(zhuǎn)錄水平的表達是上調(diào)的。為了調(diào)查豬Coronin1A基因在副豬嗜血桿菌感染過程中的分子機制，我們研究了豬Coronin1A在吞噬溶酶體形成和先天免疫應答相關的NF-κB信號通路的作用。主要研究內(nèi)容如下:
　　 1.豬Coronin1A在副豬嗜血桿菌感染過程中可能參與阻止吞噬溶酶體的形成
　　 我們運用免疫組化和STRING分析發(fā)現(xiàn)Coronin1A在

5、感染副豬嗜血桿菌的淋巴結(jié)、脾臟和肺臟中是上調(diào)表達的，說明豬Coronin1A與副豬嗜血桿菌感染相關。另外，我們發(fā)現(xiàn)了7個與Coronin1A相關的上調(diào)表達的差異表達基因，分別是Slc9a3r1、Ltb、I1-1β、Fcgr2β、Ly86、Cd14和Cc14，它們可能有助于副豬嗜血桿菌抵抗機體的吞噬作用或免疫應答。再者，亞細胞定位結(jié)果表明豬Coronin1A主要分布于胞漿內(nèi)，與微管蛋白部分共定位，微管蛋白與形成吞噬溶酶體的皮質(zhì)微管網(wǎng)絡相關

6、。最重要的是，Coronin1A在感染副豬嗜血桿菌的豬肺泡巨噬細胞中定位的結(jié)果顯示，Coronin1A蛋白聚集于吞噬有活的副豬嗜血桿菌的吞噬小體上。相反，Coronin1A蛋白起初聚集于吞噬有熱致死細菌的吞噬小體上，隨即迅速從吞噬小體上離解開來，繼而菌體被運送到溶酶體中，在吞噬溶酶體的作用下被機體清除。
　　 2.豬Coronin1A在副豬嗜血桿菌感染過程中有助于抑制NF-κB信號通路
　　 我們通過相對定量PCR和LP

7、S、Poly(I∶C)體外刺激實驗，發(fā)現(xiàn)豬Coronin1A主要表達于造血組織及細胞中，而免疫刺激實驗發(fā)現(xiàn)LPS和Poly(I∶C)均能夠在體外刺激豬Coronin1A基因的表達。另外，豬Coronin1A能夠抑制NF-κB的激活，其機制是通過抑制IκBα的降解和p65的核轉(zhuǎn)位。并且豬Coronin1A的過表達能夠通過抑制NF-κB信號通路從而導致NF-κB調(diào)控的下游炎性因子（IL-6、IL-8和COX-2）的下調(diào)表達。再者，我們研究發(fā)