豬胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌、副豬嗜血桿菌復(fù)合PCR檢測方法以及豬胸膜肺炎放線桿菌PCR-ELISA檢測方法的建立.pdf

1、胸膜肺炎放線桿菌(Actinobacillus pleuropneumoniae，App)是一種高度傳染性病原菌，能引起豬的出血性、化膿性和纖維素性肺炎。多殺性巴氏桿菌(Pasteurellamultocida，Pm)可以引起豬肺疫和豬的萎縮性鼻炎。副豬嗜血桿菌(Hamophilusparasuis，Hps)是一種條件致病菌，可以引起豬的纖維素性肺炎，關(guān)節(jié)炎和腦膜炎。胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌都是豬呼吸道常見的重要致

2、病菌，都可能導(dǎo)致或者繼發(fā)于其他病原感染，給養(yǎng)豬業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。這三種細(xì)菌引起的臨床癥狀很難區(qū)分，多重感染也給傳統(tǒng)的細(xì)菌學(xué)診斷方法帶來困難。因此，本研究建立了一種能夠快速診斷鑒別這三種細(xì)菌的復(fù)合PCR檢測方法。 PCR檢測方法在檢測臨床樣本時，尤其是當(dāng)多種其他物種的DNA存在時，可能會出現(xiàn)非特異性擴(kuò)增。當(dāng)非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的大小和預(yù)計陽性產(chǎn)物大小相似時，就可能發(fā)生誤判，出現(xiàn)假陽性結(jié)果。為了對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定性，提高檢測方法的特

3、異性和敏感性，本研究還建立了針對胸膜肺炎放線桿菌的PCR-ELISA檢測方法。 一、豬胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌復(fù)合PCR檢測方法的建立 本研究根據(jù)胸膜肺炎放線桿菌apxVIA基因序列設(shè)計用來檢測胸膜肺炎放線桿菌的引物App-Apx-upper和App-Apx-lower。根據(jù)多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌16S rRNA基因的種特異性序列設(shè)計多殺性巴氏桿菌的特異性下游引物Pm-16S-lower和副豬

4、嗜血桿菌的特異性下游引物Hps-16S-lower。Co-16S-upper和Co-16S-lower根據(jù)細(xì)菌16S rRNA基因前端和末端的保守區(qū)域序列設(shè)計，可以和研究中涉及的所有細(xì)菌的模板反應(yīng)，擴(kuò)增出大小約為1370-1400bp的產(chǎn)物(不同細(xì)菌大小略有差異)。Co-16S-upper在復(fù)合PCR體系里作為多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的共同上游引物。豬胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌模板的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物大小分別為342

5、bp、485bp和1258bp。復(fù)合PCR對1～12型豬胸膜肺炎放線桿菌標(biāo)準(zhǔn)株，6株多殺性巴氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)株，1～15型副豬嗜血桿菌以及25株經(jīng)生化鑒定確認(rèn)為上述三種細(xì)菌的分離株的基因組DNA作為模板進(jìn)行檢測，均獲得預(yù)期大小的擴(kuò)增產(chǎn)物。以豬放線桿菌、吲哚放線桿菌等15種常見細(xì)菌作為陰性對照進(jìn)行PCR檢測，結(jié)果均為陰性。復(fù)合PCR針對胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的敏感性分別為32pg、34pg和67pg。本研究建立的復(fù)合PC

6、R檢測方法有比較好的特異性和敏感性，可以用于豬胸膜肺炎放線桿菌、多殺性巴氏桿菌和副豬嗜血桿菌的快速檢測。 二、豬胸膜肺炎放線桿菌PCR-ELISA檢測方法的建立 本研究的目的是建立具有更高特異性和敏感性的豬胸膜肺炎放線桿菌的診斷方法。所有血清型的豬胸膜肺炎放線桿菌都具有apxVIA基因，并且該基因3’端，5’端和中部的部分區(qū)域序列十分保守。本研究通過序列比對，選擇保守區(qū)域設(shè)計引物Apx IV-upper和Apx IV-l

7、ower，其中Apx IV-upper的5’端標(biāo)記生物素。為了對PCR產(chǎn)物進(jìn)行定性，本研究根據(jù)擴(kuò)增區(qū)域內(nèi)部的序列設(shè)計了種特異性探針P1和P2。P1和P2的序列相同，只是P1的5’端標(biāo)記了地高辛。種特異性的探針以液相雜交的方式檢測PCR產(chǎn)物。探針在較高的退火溫度條件下僅僅與完全匹配的DNA鏈雜交，避免了普通PCR可能出現(xiàn)的假陽性結(jié)果，提高了檢測方法的特異性。PCR-ELISA具有二級信號放大系統(tǒng)，即PCR擴(kuò)增和ELISA信號放大。本研究建