豬胸膜肺炎放線桿菌雙組份調(diào)控系統(tǒng)PhoBR的功能研究.pdf

1、豬傳染性胸膜肺炎（Porcine Contagious Pleuropneumonia，PCP），是由豬胸膜肺炎放線桿菌（Actinobacillus pleuro pneumoniae，APP）引起的一種豬的傳染性呼吸道疾病，在世界范圍內(nèi)對養(yǎng)豬業(yè)造成巨大損失。磷是病原菌一種重要的營養(yǎng)元素，在信號傳導和能量代謝中起重要的作用。糖類作為碳源，對于細菌的生長有著至關(guān)重要的作用。在肺臟磷和碳源缺乏的情況下，有效均衡的生理反應(yīng)和各種糖類的攝取利

2、用，對于APP在豬呼吸道與肺臟中的生存定植具有非常重要的意義。
　　病原菌在感染宿主的過程中，能通過雙組份調(diào)控系統(tǒng)(Two-Component Regulatory System，TCS)密切感受和響應(yīng)體內(nèi)外各種微環(huán)境的變化，進而調(diào)節(jié)各種基因表達以完成其致病的過程。APP血清3型JL03的全基因組測序分析，表明APP具有5對完整的雙組份調(diào)控系統(tǒng):ArcA/B，CpxA/R，NarP/Q，PhoB/R，QseB/C。眾多研究者對Ph

3、oBR雙組份轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的研究表明:在磷限制培養(yǎng)條件下，PhoBR參與調(diào)控磷、糖的代謝和相關(guān)毒力因子的表達，但當前未見PhoBR在豬傳染性胸膜肺炎中調(diào)控致病機制的研究。
　　鑒于以上背景，本研究選用APP血清1型強毒力菌株SLW01作為親本菌株，構(gòu)建了SLW01的雙基因缺失突變株△phoBR，同時構(gòu)建了△phoBR基因缺失突變株的互補菌株C△phoBR。對突變株△phoBR進行了生物學特性和對小鼠致病力的研究，并在磷限制與正常培養(yǎng)情況

4、下，通過Agilent單通道表達譜芯片和qRT-PCR，篩選突變株△phoBR與親本株SLW01差異表達基因，初步探討了PhoBR調(diào)控APP的可能致病機制。主要研究內(nèi)容如下:
　　1.雙基因缺失突變株△phoBR與互補菌株C△phoBR的構(gòu)建與鑒定。
　　參考APP血清3型JL03的全基因組序列，設(shè)計引物，以APP血清1型SLW01基因組為模板，擴增phoB/R基因的上下游同源臂片段，將上下游片段分別連接到pEMD-18T載

5、體上，酶切鑒定回收，連接到自殺性質(zhì)粒pEMOC2，經(jīng)酶切驗證，成功構(gòu)建了插入2272bp外源片段的重組質(zhì)粒pEM-phoBR。測序表明，該外源片段與模板序列100％同源，將重組質(zhì)粒pEM-phoBR轉(zhuǎn)化至大腸桿菌β2155，作為供體菌與親本株SLW01做接合轉(zhuǎn)移，獲得整合了pEM-phoBR重組質(zhì)粒的單交換菌株，通過蔗糖負向篩選和氯霉素正向篩選，結(jié)合PCR鑒定，篩選出對氯霉素敏感，具有蔗糖抗性的克隆，進一步通過測序和熒光定量證實雙基因缺

6、失突變株△phoBR構(gòu)建成功。
　　參考APP血清3型JL03的全基因組序列，設(shè)計引物，以APP血清1型SLW01基因組為模板，擴增phoB/R基因片段，將該目的片段依次連接pEMD-18T、APP-E.coli穿梭質(zhì)粒pJFF224-XN，構(gòu)建重組表達質(zhì)粒pJFF-phoBR，酶切、測序鑒定，該外源片段與phoB/R基因序列100％同源。將該重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化至雙基因缺失突變株△phoBR，經(jīng)PCR和RT-PCR鑒定，證實互補菌株C

7、△phoBR構(gòu)建成功。
　　2.突變株△phoBR生物學特性研究
　　對突變株△phoBR進行生物學特性研究的結(jié)果表明:△phoBR可在體外穩(wěn)定遺傳;在正常培養(yǎng)條件下，突變株△phoBR體外增殖能力相比較野生株生長速率明顯變慢，活菌數(shù)下降。在磷限制培養(yǎng)條件下，突變株△phoBR體外增殖能力與野生株SLW01基本一致;小鼠LD50實驗表明:突變株△phoBR相比于親本株SLW01和互補菌株C△phoBR毒力分別上升1.73倍和

8、2.05倍（Korbor寇氏法）。小鼠存活率實驗表明:相同感染劑量，突變株△phoBR組14只僅存活一只，存活率為7.14％。親本株SLW01組最終14只存活6只，存活率42.86％，毒力差異顯著;小鼠載菌量實驗表明:在入侵與感染初期，突變株△phoB/R肺與血液中的載菌量顯著高于野生株SLW01。隨著感染時間的延長至120h，兩者在肺組織中的菌量基本趨于一致，而在血液中的突變株的載菌量還維持在一個較高的水平;中性粒細胞殺傷實驗表明，突

9、變株△phoBR抵抗PMN殺傷能力相比于親本株SLW01增強，差異極顯著。以上結(jié)果表明，突變株△phoBR毒力相比于親本株毒力上升。
　　3.PhoBR調(diào)控機制的探討
　　對突變株△phoBR與親本菌株SLW01差異表達基因進行分析，結(jié)果顯示，在正常培養(yǎng)條件下，突變株△phoBR相比于親本株SLW01上調(diào)表達2倍以上基因5個下調(diào)表達基因7個，這12個基因主要與糖類轉(zhuǎn)運代謝先關(guān);在磷限制培養(yǎng)條件下，突變株△phoBR相比于野生