胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體和多殺性巴氏桿菌基因芯片檢測與分型研究.pdf

1、基因芯片技術(shù)能在單一檢測中從種、亞種、型和亞型水平上同時鑒定多種病原，為多病原聯(lián)合檢測和病原分型提供了一項新技術(shù)?；蛐酒夹g(shù)具有敏感性高，特異性強、高通量和平行性的優(yōu)點。本研究對胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體和多殺性巴氏桿菌的檢測和分型靶基因進(jìn)行了設(shè)計，以PCR方法擴增出用于三種細(xì)菌聯(lián)合檢測和胸膜肺炎放線桿菌分型的靶基因，并建立了檢測三種細(xì)菌和胸膜肺炎放線桿菌基因分型的基因芯片。建立的APP-Mhp-PM檢測基因芯片和APP分型基因芯

2、片是一種新的檢測技術(shù)，將對監(jiān)測、聯(lián)合診斷和防治這三種豬呼吸道細(xì)菌病發(fā)揮重要作用。 根據(jù)胸膜肺炎放線桿菌的16SrDNA、apxIVA、dsbE、omlA、apx和莢膜多糖(cp)基因，豬肺炎支原體的16SrDNA和P36蛋白基因，多殺性巴氏桿菌的psl和KMTl基因，λ噬菌體DNA共設(shè)計和選用了23對引物，除選用引物外，其它引物由Arraydesigner2.0軟件設(shè)計。用23對引物共擴增出25個不同靶基因，并克隆到pMD18-

3、T載體中。其中7個檢測靶基因：胸膜肺炎放線桿菌3個(apxIV、dsbE、A16S)，豬肺炎支原體2個(Ml6S、P36)，多殺性巴氏桿菌2個(psl、KMTl)；17個用于胸膜肺炎放線桿菌分型的靶基因：omlA1、omlA2、omlA3、omlA4、cps1、cps2、cps6、cps7、cps8、cpx3、cpx6、cpx9、apxIA、apxID、apxIIA、apxIIIA和apxIIID；一個定位靶基因λDNA。對克隆的25個

4、靶基因質(zhì)粒進(jìn)行了序列測定和序列比對。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，靶基因A16S與放線桿菌屬內(nèi)所有放線桿菌的16SrRNA的同源性均在95％以上，靶基因M16S與豬肺炎支原體、絮狀支原體和豬鼻支原體的16SrRNA的同源性分別為100％、95％和88％；靶基因apxIV、dsbE、P36、KMTl和psl與各自不同型或株的相同基因序列的同源性均在92％以上。除分型靶基因apxID和apxIIID序列間的同源性在75％外，其它分型靶基因序列間的同源性均在67

5、％以下。 用7個檢測靶基因制備APP-Mhp-PM檢測基因芯片，選用omlA1、omlA2、omlA3、omlA4、cps1、cps2、cps6、cps7、cps8、cpx6、apxIA、apxID、apxIIA、apxIIIA和apxIIID15個分型靶基因制備APP分型基因芯片。靶基因A16S、dsbE和apxIV聯(lián)合檢測胸膜肺炎放線桿菌；靶基因M16S和36聯(lián)合檢測豬肺炎支原體；靶基因psl和KMTl聯(lián)合檢測多殺性巴氏桿菌

6、。15個分型靶基因的不同組合用于胸膜肺炎放線桿菌的基因分型。用基因芯片點樣儀SpotArray24將異丙醇沉淀法制備的濃度在250～300ng/μl的檢測和分型靶基因點制在同一氨基化玻片的三個9mm×9mm亞陣列中。每個靶基因10點，點與點中心距為800μm，點的直徑為200μm；點樣環(huán)境濕度55～65％，溫度15～30℃，點樣后室溫過夜。點制好的基因芯片進(jìn)行水合處理、紫外線交聯(lián)和洗滌。以煮沸法提取的細(xì)菌基因組為模板用PCR方法標(biāo)記單個

7、基因探針，然后在55℃、58℃、60℃和62℃四個不同溫度下雜交，室溫下于4種不同洗滌液中洗滌芯片。在同一參數(shù)下用ScanArray(R)4000掃描儀和QuantArray(R)分析軟件對雜交后的基因芯片進(jìn)行掃描和圖像數(shù)據(jù)分析。篩選出60℃為檢測和分型基因芯片的雜交溫度，確定信號總值方式輸出數(shù)據(jù)。除靶基因apxID和apxIIID間存在一定交叉雜交外，其它所有靶基因間沒有交叉雜交信號。制備的基因芯片性能穩(wěn)定，能重復(fù)使用10次。通過最弱

8、信號法和所有靶基因雜交結(jié)果綜合確定了靶基因陽性雜交的初步判定標(biāo)準(zhǔn)：只有當(dāng)總信號值大于250、信噪比值≥1.5和掃描圖像后的同一靶基因的10個雜交點中至少有8個雜交點能肉眼清晰可見才能判定為陽性雜交。 用優(yōu)化后的多重PCR標(biāo)記方法標(biāo)記檢測和分型探針，并同時建立了一種用于檢測胸膜肺炎放線桿菌的多重PCR方法。用APP-Mhp-PM檢測基因芯片對不同型或株的胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體和多殺性巴氏桿菌進(jìn)行了檢測，結(jié)果檢測信號強，SN

9、R值高。APP-Mhp-PM檢測基因芯片的特異性高，與豬大腸桿菌、豬丹毒桿菌、腸炎沙門氏桿菌、豬鏈球菌、豬副嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、PRV的基因組DNA沒有交叉雜交信號。檢測基因芯片的靈敏度高，能檢測5pg/50μl標(biāo)記體系的胸膜肺炎放線桿菌基因組DNA，而建立用于檢測胸膜肺炎放線桿菌的多重PCR方法的靈敏度為10pg/50μl反應(yīng)體系的胸膜肺炎放線桿菌基因組DNA。胸膜肺炎放線桿菌1～4，6～10型標(biāo)準(zhǔn)株和MC、MH、MY三株分離株

10、與APP分型基因芯片分別進(jìn)行了雜交，結(jié)果9個標(biāo)準(zhǔn)血清型菌株有各自獨特的雜交模式，而MC、MH、MY三株分離株的雜交模式分別與3、7和1型標(biāo)準(zhǔn)株的雜交模式相同。用檢測基因芯片檢測了45頭臨床病豬的不同病料的選擇培養(yǎng)混合物，多殺性巴氏桿菌的檢出率最高為71.11％，胸膜肺炎放線桿菌的檢出率為42.22％，豬肺炎支原體檢出率最低為20％，48.89％的病豬呈混合感染狀態(tài)。用建立的多重PCR方法對45頭病豬的胸膜肺炎放線桿菌選擇培養(yǎng)混合物進(jìn)行了

11、檢測，檢出率為42.22％，與檢測基因芯片結(jié)果相同。從臨床病料分離的11株APP分離株與APP分型基因芯片進(jìn)行雜交，結(jié)果有5株與3型標(biāo)準(zhǔn)株的雜交模式相同，5株與7型標(biāo)準(zhǔn)株雜交模式相同，1株與1型標(biāo)準(zhǔn)株雜交模式相同。 在本試驗的雜交條件下，APP-Mhp-PM檢測基因芯片能從核酸雜交水平上對胸膜肺炎放線桿菌、豬肺炎支原體和多殺性巴氏桿菌同時進(jìn)行多基因鑒定和檢測，適合用于三種細(xì)菌的鑒定和混合感染豬的檢測。APP分型基因芯片能對胸膜肺