豬肺炎支原體P46基因在大腸桿菌中的克隆、表達與ELISA方法研究.pdf

1、豬肺炎支原體(Mycoplasma Nyopneumoniae,M.hp)P46蛋白是M.hp的表面膜蛋白,具有種特異性.M.hp兔化弱毒株R659株、濟南強毒株、強毒Z株、國際標準株232的P46基因被克隆到pGEM-T-Easy載體上,經(jīng)測序表明,克隆序列全長1152bp,編碼383個氨基酸和一個終止子(TAA);該序列中含有3個TGA編碼Trp,而不是終止密碼子.比較兔化弱毒株與濟南強毒株、國際標準株232及NCBI上發(fā)布的J株的

2、P46基因序列,發(fā)現(xiàn)它們的同源性分別為98.6％、99.2％、99.2％;比較它們編碼的氨基酸發(fā)現(xiàn)它們的同源性分別為98.7％、99.2％、99.2％.結(jié)果表明豬肺炎支原體的P46基因在豬肺炎支原體種內(nèi)是很保守的,因此建立以P46蛋白為診斷抗原的ELISA具有重要的意義.利用PCR方法將克隆在pGEM-T-easy上的豬肺炎支原體P46基因進行突變,將編碼Trp的密碼子TGA突變?yōu)門GG,確保P46基因能在大腸桿菌中表達.將突變后的P4

3、6基因克隆到表達載體pMAL-P2X和pMAL-C2X中,測序驗證重組表達載體的讀碼框正確.將重組的表達載體pMAL-P2X-P46和pMAL-C2X-P46分別轉(zhuǎn)化表達工程菌TB1、BL21-DE3和BL21-codon plus-RP,得到6株重組表達菌.pMAL-P2X-P46和pMAL-C2X-P46在BL21-codon plus-RP中以包涵體的形式表達,IPTG的最小誘導(dǎo)濃度為0.07mM.然而,pMAL-P2X-P46和

4、pMAL-C2X-P46在TB1和BL21-DE3中為可溶性表達,其中,pMAL-P2X-P46的表達產(chǎn)物分泌到細胞周質(zhì),在TB1和BL21-DE3中表達時,表達的融合蛋白均可達周質(zhì)分泌物的50％左右.pMAL-C2X-P46的表達產(chǎn)物釋放到胞漿,IPTG的最小誘導(dǎo)濃度為0.4mM,在TB1和BL21-DE3中表達時,表達的融合蛋白約占細胞裂解上清30％左右.在Western-Blotting實驗中,用兔抗豬肺炎支原體高免血清和兔抗MB

5、P高免血清證實了誘導(dǎo)表達產(chǎn)物為MBP和P46蛋白組成的融合蛋白.M.hp的P46基因在大腸桿菌中可溶性的表達不僅對于建立M.hp的ELISA檢測方法打下了基礎(chǔ),對于豬肺炎支原體多肽疫苗研究和支原體的功能基因組學(xué)具有重要意義.利用強陰離子交換柱Q XL在pH 7.0,25mM的Tris-C1緩沖液體系下能初步的純化融合蛋白MBP-P46,通過分子篩SephacryI S-100能進一步純化融合蛋白,純化后的融合蛋白經(jīng)Xa因子酶切后,得到P

6、46蛋白.用強陽離子交換柱SP XL,在pH5.0,25mM的檸檬酸鈉的緩沖液體系下可純化P46蛋白.純化的MBP-P46和P46經(jīng)過Western-Blot實驗證實后用于ELISA實驗.比較以MBP-P46蛋白和P46蛋白做為抗原建立的ELISA方法,發(fā)現(xiàn)P46蛋白作為檢測抗原更加敏感,每孔包被P46抗原lug或0.5ug,檢測20倍稀釋的參考血清,P/N值最高可達7.6.該研究為我們進一步建立以P46蛋白為診斷抗原的ELISA方法打