豬肺炎支原體P97蛋白的抗原學(xué)分析及鑒定.pdf

1、豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）是引起豬地方性肺炎的主要病原體。該病導(dǎo)致豬生產(chǎn)性能下降，并增加由繼發(fā)感染引起的死亡率，因而對(duì)養(yǎng)豬業(yè)造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失。Mhp對(duì)呼吸道上皮細(xì)胞的黏附是感染發(fā)生的關(guān)鍵步驟。P97是豬肺炎支原體一種重要的黏附蛋白，并且在支原體感染過程中發(fā)揮著重要的功能。
　　本研究首先利用DNaseⅠ將p97突變基因隨機(jī)消化成100-250bp的DNA小片段，將這些隨機(jī)小片段插入到

2、酵母表面展示載體pCTCON-2中，獲得的酵母文庫的庫容量為106數(shù)量級(jí)。通過對(duì)隨機(jī)挑取100個(gè)單克隆進(jìn)行測(cè)序分析，100個(gè)克隆中插入的突變p97隨機(jī)小片段覆蓋了整個(gè)p97突變基因。在這些片段中，正向插入的片段有53個(gè)，占挑取克隆數(shù)的53％;反向插入的有47個(gè)，占47％，正向和反向插入的片段比例接近于1∶1。片段隨機(jī)分布，豐度均勻，片段大小主要集中在100-250bp之間，抗原肽序列在30-60aa之間。因?yàn)锽細(xì)胞表位大小大部分在8-2

3、0aa之間，從該酵母庫篩選出的陽性抗原肽更接近精確表位序列。因此該文庫可以用于分析P97蛋白的抗原區(qū)。
　　利用流式細(xì)胞分選技術(shù)篩選出文庫中能與天然感染Mhp的豬陽性血清結(jié)合的陽性酵母克隆，根據(jù)分選結(jié)果，將P97蛋白劃分7個(gè)抗原區(qū)域。為了驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的正確性，我們首先將P97不同區(qū)域的蛋白再次展示到酵母表面，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行分析。同時(shí)將7個(gè)抗原區(qū)蛋白進(jìn)行原核表達(dá)并純化蛋白，利用ELISA方法對(duì)各抗原區(qū)蛋白的抗原特性進(jìn)行反向驗(yàn)證。

4、兩種分析結(jié)果表明，D6區(qū)為P97蛋白的主要抗原區(qū)，反應(yīng)原性最強(qiáng)，其次為D2、D4抗原區(qū)蛋白，D5、D7可能存在P97蛋白的構(gòu)象型表位，D1、D3抗原區(qū)的反應(yīng)原性最弱。
　　分選后獲得與血清反應(yīng)較強(qiáng)的184號(hào)以及104號(hào)酵母克隆，為了驗(yàn)證兩個(gè)克隆中插入的184號(hào)和104號(hào)抗原肽是否為最小的抗原表位，我們進(jìn)一步分別從184短肽C端及104號(hào)短肽N端逐個(gè)缺失氨基酸，再次將其展示到酵母細(xì)胞表面，篩選得到一個(gè)長度為15個(gè)氨基酸的184D(D