豬肺炎支原體的分離鑒定及其主要抗原蛋白基因的克隆與序列分析.pdf

1、豬肺炎支原體（Mycoplasma hyopneumoniae，Mhp）是豬支原體肺炎（Mycoplasmal pneumonia of swine, MPS）的主要病原體，也是豬呼吸道病綜合征（Porcine Respiratory Disease Complex，PRDC）的主要原發(fā)性病原之一。MPS廣泛存在于世界各地，主要危害是引起豬咳嗽、喘氣、生長受阻和飼料轉(zhuǎn)化率大幅下降，嚴重影響?zhàn)B豬業(yè)的經(jīng)濟效益。為了進一步了解 Mhp在廣東的

2、流行及主要抗原蛋白的變異情況，本研究從屠宰豬肺組織分離鑒定了一株 Mhp，并觀察其培養(yǎng)特性、致病性、抗菌藥物敏感性。同時克隆分離株主要抗原蛋白基因P46、P65蛋白C末端和P97蛋白R1R2區(qū)編碼序列，與國際標準株核苷酸序列和推導的氨基酸序列進行同源性比較，分析 P46、P65和P97的抗原指數(shù)。研究結(jié)果報告如下。
　?。?）本研究從100多份屠宰肺組織樣品中分離到一株疑似Mhp，通過菌株的培養(yǎng)特性、形態(tài)觀察、生化試驗、血清學鑒定

3、和P46基因序列分析證實該分離株為Mhp，命名為GDZJ01。
　?。?）將分離菌株 GDZJ01分別接種到牛心湯培養(yǎng)基、改良 KM2培養(yǎng)基和改良Hayflick培養(yǎng)基中，測定其在3種不同培養(yǎng)基中生長滴度、生長速度，并測定了GDZJ01在最適培養(yǎng)基中不同培養(yǎng)階段的生長滴度。結(jié)果表明，添加15％馬血清或20%豬血清的改良 Hayflick培養(yǎng)基最適宜 Mhp生長，生長滴度可達108CCU/mL，在培養(yǎng)6h后開始進入對數(shù)生長期，培養(yǎng)4

4、2h后進入穩(wěn)定期，培養(yǎng)54h時后進入衰亡期。
　?。?）通過卵黃囊接種，GDZJ01可在6日齡雞胚生長繁殖，并致死雞胚，說明GDZJ01具有一定致病性，但比標準株7448株弱。
　　（4）MIC測定結(jié)果表明，分離株GDZJ01對大多數(shù)支原體治療常用抗菌藥物敏感性下降，對林可霉素、土霉素、氟甲喹、金霉素產(chǎn)生了耐藥性，對環(huán)丙沙星、氟苯尼考、泰妙菌素、替米考星有較高敏感性。結(jié)果為指導臨床用藥治療MPS提供了實驗數(shù)據(jù)支持，提示了未來

5、用抗菌藥物預防和治療Mhp感染將變得越來越困難。
　　（5）采用常規(guī)方法，克隆了分離株GDZJ01的P46基因、P65基因的C末端和P97基因的C末端R1R2區(qū)域。結(jié)果表明，P46和P65基因高度保守，與標準株J株、232株和7448株的核苷酸序列同源性分別為98.9%-99.1%和99.2%-99.7%，氨基酸序列同源性分別為99.3%-99.5%和99.5%-100%；而P97基因變異較大，R1R2區(qū)域的核苷酸序列同源性為86