豬肺炎支原體MY-99株P(guān)46基因的克隆測序及原核表達.pdf

1、豬肺炎支原體(Mycoplasmahyopneuminiae，Mhp)是豬支原體肺炎的病原體。P46基因是編碼豬肺炎支原體膜蛋白P46的基因片段，P46膜蛋白被認為是Mhp的特異性表面蛋白。 本研究根據(jù)已報道的序列，設(shè)計了一對帶有BAMHⅠ和HINDⅢ酶切位點的引物，利用PCR從Mhp野毒株MY-99擴增出了P46基因，經(jīng)克隆測序，該基因序列全長1134bp，編碼378個氨基酸，預計其表達的蛋白分子量為41.49KDa，PI值為

2、5.97。該基因序列中含有3個TGA編碼Trp，將MY-99株的P46基因與Mhp國際標準株232株、J株和7446株比較其的同源性達到99％，且其編碼氨基酸的同源性也達99％以上。 P46基因經(jīng)過克隆，通過設(shè)計的引物進行定點突變，利用引物分別針對3個位點的TGA進行修飾，通過測序驗證，我們成功地對MY-99株的基因進行了改造,將182、381和734位的A突變G，并將T載體內(nèi)的P46基因亞克隆嵌入表達載體pet-32a(+)，

3、構(gòu)建了pet-32a(+)-P46重組質(zhì)粒。 將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化進表達菌rosetta，得到重組表達菌Ro-CTB600。在IPTG的誘導下，P46蛋白在重組表達菌中獲得了融合表達，得到了融合蛋白Trx-P46。通過SDS-PAGE分離純化表達的融合蛋白Trx-P46產(chǎn)物檢測證實，重組表達的Mhp-MY-99株的P46為融合蛋白，其大小與預測的分子量相同為61.79KDa(其重組質(zhì)粒中由TrxA及其它附加序列編碼蛋白的分子量約為20